Скачивание материала началось

Предлагаем Вам установить расширение «Инфоурок» для удобного поиска материалов:

ПЕРЕЙТИ К УСТАНОВКЕ

Новый курс повышения квалификации!

Цифровая грамотность педагога. Дистанционные технологии обучения

Разработан летом 2020 специально для учителей

Успеть записаться

-50% До конца лета

Каждую неделю мы делим 100 000 ₽ среди активных педагогов. Добавьте свои разработки в библиотеку “Инфоурок”
Добавить авторскую разработку
и получить бесплатное свидетельство о публикации в СМИ №ФС77-60625 от 20.01.2015
Инфоурок Другое Другие методич. материалы"Генная терапия -медицина 21 века"

"Генная терапия -медицина 21 века"

библиотека
материалов


ГБПОУ МО «Московский областной медицинский колледж №4»

Сергиево -Посадский филиал











УЧЕБНО – ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

« В МИРЕ ИННОВАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ »





Доклад на тему: «ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ - МЕДИЦИНА 21 ВЕКА»











Выполнил

Студент 23-15 СД группы

Рысенко Артем

Руководитель

Торопова О.А.









Сергиев Посад

2017

Содержание

Введение …………………………………………………………………………………3

1. Методы доставки гена в клетки…………………………………………………….4

2.Методы генной терапии………………………………………………………………5

3. Судьба гена после его попадания в клетку………………………………………...7

Заключение……………………………………………………………………………….8

Список использованной литературы…………………………………………………9





Введение

С каждым годом появляется всё больше статей о медицинских клинических исследованиях, в которых, так или иначе, применялось лечение, основанное на введении различных генов – генная терапия. Это направление выросло из таких хорошо развивающихся разделов биологии, как молекулярная генетика и биотехнология.

Зачастую, когда обычные (консервативные) методы уже перепробованы, именно генная терапия может помочь пациентам выжить и даже полностью выздороветь. Например, это касается наследственных моногенных заболеваний, то есть таких, которые вызваны дефектом в одном единственном гене, а также и многих других .

Генную терапию сегодня можно определить как лечение заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты совсем недавно – 22 мая 1989 года в целях диагностики рака. Первым наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммунодефицит.

С каждым годом число успешно проведенных клинических испытаний лечения различных заболеваний с использованием генной терапии растёт, и к январю 2014 г. достигло 2 тысяч .

































1. Методы доставки гена в клетки

Итак, мы определились, что данное лечение основано на том, что если какие-то ткани организма испытывают недостаток некоторых отдельных белковых факторов, то это можно исправить введением в эти ткани соответствующих генов, кодирующих белки, и всё станет более или менее замечательно. Сами белки вводить не получится, потому что наш организм тут же среагирует неслабой иммунной реакцией, да и длительность действия была бы недостаточной. Теперь следует определиться с методом доставки гена в клетки.

Трансфекция клеток

Для начала стоит ввести определения некоторых терминов.

Транспорт генов осуществляется благодаря вектору – это молекула ДНК, используемая как «транспортное средство» для искусственного переноса генетической информации в клетку. Принципиально важно, что векторы (в частности, плазмидные) обладают характерными для них свойствами:

1. Точка начала репликации (ori) – последовательность нуклеотидов, с которой начинается удвоение ДНК.

2. Сайты рестрикции – специфические короткие последовательности (чаще палиндромные), которые узнаются специальными ферментами (эндонуклеазы рестрикции) и разрезаются ими определённым образом – с образованием «липких концов». Эти сайты необходимы для того, чтобы сшить векторную ДНК (которая, по сути, является «болванкой») с нужными терапевтическими генами в единую молекулу. Такая сшитая из двух или нескольких частей молекула зовётся «рекомбинантной»;

3. Понятно, что нам желательно бы получить миллионы копий рекомбинантной молекулы ДНК. Опять-таки, если мы имеем дело с культурой клеток бактерий, то далее эту ДНК нужно выделить. Проблема заключается в том, что далеко не все бактерии проглотят нужную нам молекулу, некоторые не станут этого делать. Чтобы эти две группы всё-таки различить, в векторную ДНК вставляют селективные маркёры – участки устойчивости к определённым химическим веществам; теперь если в среду добавить эти самые вещества, то выживут только те, которые обладают устойчивостью к ним, а остальные погибнут.

Все эти три составляющие можно наблюдать и в самой первой искусственно синтезированной плазмиде.

Сам процесс внедрения плазмидного вектора в определённые клетки называется трансфекцией. Плазмида – это довольно короткая и обычно кольцевая молекула ДНК, которая находится в цитоплазме бактериальной клетки. Плазмиды не связаны с бактериальной хромосомой, они могут реплицироваться независимо от нее, могут выбрасываться бактерией в окружающую среду или, наоборот, поглощаться (процесс поглощения – трансформация). С помощью плазмид бактерии могут обмениваться генетической информацией, например, передавать устойчивость к определённым антибиотикам.

Плазмиды существуют в бактериях в естественных условиях. Но никто не может помешать исследователю искусственно синтезировать плазмиду, которая будет обладать нужными для него свойствами, вшить в нее ген-вставку и внедрить в клетку. В одну и ту же плазмиду можно вшивать разные вставки .

2.Методы генной терапии

Существует два основных подхода, различающиеся природой клеток-мишеней:

1. Фетальная, при которой чужеродную ДНК вводят в зиготу (оплодотворённую яйцеклетку) или эмбрион на ранней стадии развития; В нашей стране она фактически запрещена [6];

2. Соматическая, при которой генетический материал вводят уже родившемуся в неполовые клетки и он не передаётся половым клеткам.

Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения лёгочных заболеваний (муковисцидоз, рак лёгких).

Существует множество методов внедрения чужеродной ДНК в эукариотическую клеткуСразу стоит оговориться, что обычно комбинируются химические и физические методы (например, электропорация + окутывание ДНК липосомами).

Прямые методы:

1. Трансфекция на химической основе может быть классифицирована на несколько видов: с использованием вещества циклодекстрина, полимеров, липосом или наночастиц (с или без химической или вирусной функционализации, т.е. модификации поверхности):

а) Один из самых дешевых методов – использование фосфата кальция. Он повышает эффективность включения

б) Применение сильноразветвленных органических молекул – дендример, для связывания ДНК и переноса её в клетку:

в) Очень эффективным методом для трансфекции ДНК является внедрение её через липосомы – малые, окруженные мембраной тельца, которые могут сливаться с клеточной цитоплазматической мембраной (ЦПМ), представляющая собой двойной слой из липидов. Для эукариотических клеток трансфекция производится эффективнее с применением катионных липосом, потому что клетки к ним более чувствительны. Процесс имеет своё название – липофекция. Этот метод сегодня считается одним из самых безопасных.

г) Еще один метод – использование катионных полимеров, таких как диэтиламиноэтил–декстран или полиэтиленимин. Отрицательно заряженные молекулы ДНК связываются с положительно заряженными поликатионами, и этот комплекс далее проникает в клетку путём эндоцитоза.

2. Физические методы:

а) Электропорация – очень популярный метод; мгновенное повышение проницаемости мембраны достигается за счет того, что клетки подвергаются коротким воздействиям интенсивного электрического поля. Показано, что в оптимальных условиях количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток. На человеке на сегодняшний день не используется.

б) «Cell squeezing» – метод, изобретенный в 2013 г. Он позволяет доставить молекулы в клетки путём «мягкого сдавливания» клеточной мембраны.


в) Оптическая трансфекция – метод, при котором производится крошечное отверстие в мембране (около 1 мкм в диаметре) при использовании сильносфокусированного лазера;

г) Гидродинамическая трансфекция – метод доставки генетических конструкций, белков и т.д. путем контролируемого повышения давления в капиллярах и межклеточной жидкости, что вызывает кратковременное повышение проницаемости клеточных мембран и образование в них временных пор. [9];

д) Микроинъекция ДНК – введение в ядро клетки животных с помощью тонких стеклянных микротрубочек (d=0,1-0,5 мкм). Недостаток – сложность метода, высока вероятность разрушения ядра либо ДНК; можно трансформировать ограниченное число клеток. Не используется для человека.

3. Методы на основе частиц.

а) Прямой подход к трансфекции – генная пушка, при этом ДНК сцепляют в наночастицу с инертными твердыми веществами (чаще золото, вольфрам), которая затем «выстреливает» направленно в ядра клеток-мишеней. Этот метод применяется in vitro и in vivo для введения генов, в частности, в клетки мышечных тканей, например при таком заболевании, как миодистрофия Дюшена. Размеры частиц золота – 1-3 мкм.

б) Магнитофекция — метод, использующий силы магнетизма для доставки ДНК в клетки-мишени. Сначала нуклеиновые кислоты (НК) ассоциируются с магнитными наночастицами, а далее, под действием магнитного поля, частицы загоняются в клетку. Эффективность почти 100%-ная.

Отдельно стоит выделить такой метод, как РНК-трансфекция: в клетку доставляется не ДНК, а молекулы РНК – их «преёмники» в цепи биосинтеза белка; при этом активизируются специальные белки, разрезающие РНК на короткие фрагменты — т.н. малые интерферирующих РНК (миРНК).

Основные принципы доставки генов с использованием плазмидных векторов рассмотрены. Теперь можно перейти к рассмотрению вирусных методов. Вирусы – это неклеточные формы жизни, чаще всего представляющие собой молекулу нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), обёрнутой в белковую оболочку. Если вырезать из генетического материала вируса все те последовательности, которые вызывают возникновение заболеваний, то весь вирус также можно успешно превратить в «транспортное средство» для нашего гена.

Процесс внедрения ДНК в клетку, опосредованное вирусом, называется трансдукцией.

На практике чаще всего используют ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы (AAV). Для начала стоит разобраться, каким должен быть идеальный кандидат для трансдукции среди вирусов. Критерии таковы, что он должен быть:

стабилен;

ёмок, то есть вмещать достаточное количество ДНК;

инертным в отношении метаболических путей клетки;

точным – в идеале, должен встраивать свой геном в конкретный локус генома ядра хозяина и др.

В реальной жизни очень сложно скомбинировать хотя бы несколько пунктов, так что обычно выбор происходит при рассмотрении каждого индивидуального случая в отдельности.

Из всех трёх перечисленных наиболее используемых вирусов самыми безопасными и одновременно самыми точными являются AAV. Их почти что единственный недостаток – сравнительно малая ёмкость (ок. 4800 п.н.), которая, однако, оказывается достаточной для многих генов .


3. Судьба гена после его попадания в клетку

Так как с вирусными векторами всё более-менее ясно в силу их свойства более эффективно доставлять гены до конечной цели – ядра, то остановимся на судьбе плазмидного вектора.

На данном этапе мы добились того, что ДНК прошла первый большой барьер – цитоплазматическую мембрану клетки.

Далее, в комплексе с другими веществами, оболочкой или без, ей необходимо достигнуть клеточного ядра, чтобы специальный фермент – РНК-полимераза – синтезировала молекулу информационной РНК (иРНК) на матрице ДНК (этот процесс называется транскрипция). Только после этого иРНК выйдет в цитоплазму, образует комплекс с рибосомами и согласно генетическому коду синтезируется полипептид – например, фактор роста сосудов (VEGF), который начнёт выполнять определённую терапевтическую функцию (в данном случае – запустит процесс образования ветвлений сосудов в ткани, подверженной ишемии).

Что касается экспрессии введенных генов в требуемом типе клеток, то эта задача решается с помощью регуляторных элементов транскрипции. Ткань, в которой происходит экспрессия, часто определяется комбинацией специфичного для этой ткани энхансера(«усиливающей» последовательности) с определенным промотором (последовательность нуклеотидов, с которой РНК-полимераза начинает синтез), который может быть индуцируемым . Известно, что активность генов можно модулировать in vivo внешними сигналами, а так как энхансеры могут работать с любым геном, то в вектора можно вводить еще инсуляторы, которые помогают энхансеру работать независимо от его положения и могут вести себя как функциональные барьеры между генами. Каждый энхансер содержит набор участков связывания активирующих или супрессирующих белковых факторов.

Экспрессия гена зависит от его положения в геноме.

Наиболее простой путь регуляции экспрессии трансгена – это обеспечение его индикаторным промотором, который чувствителен к физиологическому сигналу, такому, как выделение глюкозы или гипоксия. Такие «эндогенные» контролирующие системы могут быть полезны в некоторых ситуациях, таких, как осуществление глюкозозависимого контроля продукции инсулина. Более надежны и универсальны «экзогенные» системы контроля, когда экспрессия гена контролируется фармакологически введением маленькой лекарственной молекулы. В настоящее время известны 4 основные системы контроля — регулируемые тетрациклином (Tet), стероидом насекомых, экдизоном или его аналогами, антипрогестиновым препаратом майфпристоном (RU486) и химическими димеризаторами, такими, как рапамицин и его аналоги.

Заключение

Обзор данных позволяет прийти к заключению, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vivo и in vitro векторные системы далеки от совершенства. Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем – стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность – все еще нуждаются в серьезных доработках.

Прежде всего, это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительному пребыванию внутри ядер). В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих.

Генная и клеточная терапия открывает блестящие перспективы для восстановления утраченных клеток и тканей и генно-инженерного конструирования органов, что, несомненно, существенно расширит арсенал методов для медико-биологических исследований и создаст новые возможности для сохранения и продления жизни человека.
























Список использованной литературы


1. Башмакова В. Молекулярное клонирование, или Как поместить в клетку чужеродный генетический материал: http://elementy.ru/lib/431719

2. Баранов В.С. Генная терапия — медицина ХХI века. Соросовский образовательный журнал, №3, 1999. С. 63-68.

3. Гоигорян А.С., Шевченко К.Г. Возможные молекулярные механизмы функционирования плазмидных конструкций, содержащих ген VEGF. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; VI(3):24-28.

4. Свердлов Е.Д. Очерки современной молекулярной генетики. Очерк 5. Трансгеноз и новая молекулярная генетика // Молек. генетика, микробиол., вирусол. — 1996. — №4. — С. 3-32.

5. Свердлов Е.Д. Очерки современной молекулярной генетики. Очерк 6. Генная терапия и медицина ХХI века // Молек. генетика, микробиол., вирусол. — 1997. — №2. — С. 3-28.

6. Соловьёва В.В., Кудряшова Н.В., Ризванов А.А. Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки (трансфекция) с помощью гистонов и других ядерных белков. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; VI(3):29-40.

7. ФЗ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» от 5.06.1997 (в ред. Федеральных законов от 12.07.2000 N 96-ФЗ, от 30.12.2008 N 313-ФЗ, от 04.10.2010 N 262-ФЗ)

8. http://en.wikipedia.org/wiki/Transfection

Курс повышения квалификации
Курс профессиональной переподготовки
Педагог-библиотекарь
Курс профессиональной переподготовки
Библиотекарь
Найдите материал к любому уроку,
указав свой предмет (категорию), класс, учебник и тему:
также Вы можете выбрать тип материала:
Общая информация

Вам будут интересны эти курсы:

Курс повышения квалификации «Экономика и право: налоги и налогообложение»
Курс повышения квалификации «Этика делового общения»
Курс повышения квалификации «Экономика: инструменты контроллинга»
Курс повышения квалификации «Правовое регулирование рекламной и PR-деятельности»
Курс повышения квалификации «Основы менеджмента в туризме»
Курс профессиональной переподготовки «Управление ресурсами информационных технологий»
Курс профессиональной переподготовки «Организация деятельности помощника-референта руководителя со знанием иностранных языков»
Курс профессиональной переподготовки «Политология: взаимодействие с органами государственной власти и управления, негосударственными и международными организациями»
Курс повышения квалификации «Международные валютно-кредитные отношения»
Курс профессиональной переподготовки «Организация и управление службой рекламы и PR»
Курс профессиональной переподготовки «Организация маркетинговой деятельности»

Оставьте свой комментарий

Авторизуйтесь, чтобы задавать вопросы.