Конструирование наноматриалов на основе белков

«Конструирование наноматериалов на основе белков».

Введение

Существует огромное количество разнообразных нанотехнологий, которые похожи тем, что есть возможность манипулировать объектами с наноразмерами.

На сегодняшний день широкое применение нашли наноматериалы в виде наноплёнок. Наноплёнки – это упорядоченные структуры, которые обладают уникальными электрическими, магнитными и оптическими свойствами. Ленгмюровские плёнки – это стопки монослоёв поверхностно-активных веществ, которых переносят с поверхности воды на твёрдую подложку. Ленгмюровские плёнки создают в том числе на основе белков - глобулярных или фибриллярных. Многие ферменты относятся к глобулярным белкам, а желатин – к фибриллярным. Поэтому актуальной проблемой является конструирование плёнок на основе белков для создания каталитических систем и биосенсоров.

Цель и задачи

Исходя из этого, целью работы было изучение методов конструирование наноматериалов на основе белков.

  Задачи были поставлены следующие:

1. Определить физико-химические параметры желатина;

2. Изучить поверхностную активность растворов желатина;

3. Исследовать сорбционные взаимодействия на границе раздела в системах растворов желатин/воздух;

4. Получить изотермы сжатия исследуемых систем;

5. Определить ферментативную активность желатиновых пленок.

Области применения

Основной областью применения ленгмюровских пленок из белков является микрооптика. Мономолекулярные слои применяют для записи и хранения информации. Так же плёнки используются в качестве биосенсоров с высокой чувствительностью, высокопродуктивных биореакторов.

Из всевозможных оптических сенсоров, получаемых из ленгмюровских пленок, перспективными являются сенсоры, основанные на люминесценции. Разработаны сенсоры, работа которых основана на эффекте поглощения пленкой электромагнитного излучения. Пленки Ленгмюра-Блоджетт используют при конструировании оптических датчиков, которые позволяют измерить кислотность. Особенностью данных пленок является способность изменять интервал кислотности, заменив матрицу ленгмюровской пленки.  

Желатиновые плёнки нашли широкое применение в медицине. Главным достоинством плёнок является то, что они позволяют уменьшить дозы лекарственных препаратов, из-за того, что препарат оказывает воздействие на зону патологии или близко к ней и происходит высвобождение лекарственного вещества в заданном месте.

Желатин получают из натурального коллагена. Белковая молекула коллагена – полипептидная цепь, состоящая из 19 аминокислот, главными из которых являются глицин, пролин, аргинин, лизин.

В качестве стандартного раствора использовался 2% раствор желатины в воде.

Уравнения для определения молекулярной массы

Молекулярный вес желатина определили по вязкости его водных растворов. Вязкость определяли на капиллярном вискозиметре Оствальда (d=0,73 мм).

   ;                                                                        (1)

где: - вязкость раствора

       - вязкость растворителя

        - время истечения желатина, сек.

        - время истечения растворителя, сек.

Пользуясь этой зависимостью, выразим удельную вязкость через время истечения:

                                                           (2)

Отнесем значение уд. вязкости к концентрации и назовем эту величину приведенной вязкостью:

                                                                   (3)

Характеристическая вязкость связана с молекулярным весом растворенного вещества следующим образом [16]:

                                       (4)

где: М – средневязкостная молекулярная масса

Получим:

 ;      ;            (5)

График

Первым этапом исследование было определение физико-химических параметров желатина. В результате определили, что молекулярный вес желатина марки  К-11 равен 74 кДа.

Уравнение ИЭТ

Так же определили ИЭТ желатины методом набухания последнего в буферных растворах.

                            (6)

где :  - масса набухшего полимера

 - масса исходного полимера.

 h – высота исходного полимера.

 h₀ – высота набухшего полимера

графики

Также было установлено, что ИЭТ желатина К-11 соответствует рН 5±0,3.

Уравнения кол-ва карб. групп

ν(-COOН)=        (моль-экв/г)                       (7)

где: N(NaOH) – нормальность раствора щелочи, моль-экв/л;

        V(NaOH) – объем раствора щелочи, мл;

        g − масса навески желатина, г;

       Vk − общий объем раствора желатина в исследуемой системе, мл;

       Va − объем аликвоты, мл.

Кислотно-основные свойства молекул желатина в водном растворе, а, следовательно, и способность к химическому связыванию молекул пероксидазы, обусловлены наличием свободных карбоксильных и аминогрупп полимера.

Экспериментальным путём определили, что количество карбоксильных групп составляет 0,79±0,006 ммоль-экв/г.

ИК

Так же образцы желатина были исследованы методом ИК-спектроскопии. Результаты исследования перед вами.

Для ИК-спектра желатина характерно наличие полосы поглощения – амид I с волновым числом 1624 см^-1, Наличие свободной карбоксильной группы в молекуле белка подтверждает пик 1708 см^-1. Колебаниям аминогруппы соответствует пик 3501 см^-1.

Состав систем

Следующим этапом исследования было определение поверхностной активности растворов желатина. В экспериментах использовали три вида растворов. Состав представлен на слайде.

Поверхностная активность (формулы)

,                                                                  

где:  − поверхностное натяжение воды при данной температуре;

 − число капель исследуемой жидкости, истекших при прохождении исследуемой жидкости от верхней до нижней риски сталагмометра;

− число капель воды, истекших при прохождении исследуемой жидкости от верхней до нижней риски сталагмометра.

Для системы II используют уравнение:

                                                          

где: σ_буф.− поверхностное натяжение фосфатного буфера при данной температуре;

n_буф.− число капель фосфатного буфера, истекших при прохождении исследуемой жидкости от верхней до нижней риски сталагмометра;

Для системы III:

                                                        

где: σ_пер.− поверхностное натяжение раствора пероксидазы при данной температуре.

Графики

Во всех системах желатин проявляет поверхностную активность и является поверхностно-активным веществом. В системе I при рН 5,5 (вблизи ИЭТ) и системе II рН 7 (частично ионизированные карбоксильные группы) поверхностные активности практически идентичны, а введение пероксидазы ведет к изменению этого параметра, что является подтверждением связывания фермента с желатиновой матрицей и вовлечения его в поверхностный слой.

Уравнение определения величины адсорбции

Чтобы найти величину адсорбции Г необходимо воспользоваться уравнением:

                                                       (11)

Рассчитываем среднее значение концентрации С_ср, а так же значения ∆С, ∆σ и ∆σ/∆С. Затем необходимо рассчитать величину предельной адсорбции Г_∞.

                                                               (12)

Зная величину Г_∞ определим площадь, занимаемую одной молекулой S₀ и толщину адсорбционного слоя (длину молекулы) δ:

                                                             (13)

                                                                (14)

где N_А – число Авогадро 6,022·10²³ моль^-1;

М – молярная масса адсорбата;

ρ – плотность адсорбата.

Графики

по результатам изучения поверхностной активности была рассчитана адсорбция Гиббса на границе раздела раствор/воздух в исследуемых системах. Данные представлены на слайде.

Все изотермы сорбции хорошо апроксимируются прямой линией и имеют вид, характерный для поверхностно-активных веществ в диапазоне низких концентраций. На полученных изотермах в данном диапазоне концентраций не наблюдаем выхода сорбционного слоя на насыщение. В I и II системах мы наблюдаем практически одинаковую крутизну прямой, а в III системе она меньше, следовательно, мы еще раз доказали, что поверхностная активность в системе желатин – пероксидаза – фосфатный буфер/воздух меньше.

Графики предельной адсорбции

Были совершены попытки аналитическим путем определить предельную адсорбцию в монослое, построив из экспериментальных данных изотермы сорбции в ленгмюровских двойных обратных координатах. Результаты представлены на слайде.

На всех зависимостях были получены отрицательные значения свободного члена в уравнении прямой, что не дало возможности оценить такие параметры как предельная адсорбция Г_∞, площадь, занимаемую одной молекулой S₀ и толщину адсорбционного слоя δ.

Определение ферментативной активности

Нами были получен препарат, путем переноса раствора желатина тонким слоем в чашки Петри с последующим высушиванием на воздухе. Их хранили в герметичных пакетах при температуре 4°С в течение 25 суток. Затем определили активность для образцов с одинаковой концентрацией пероксидазы и различной концентрацией желатина. Расчётные данные представлены в табл. 14.

Желатин является хорошей матрицей для консервирования фермента.  Данные позволяют предположить достаточно высокую активность при нанесении ленгмюровских пленок в систему желатин – пероксидаза.

График

При создании монослоев белков были получены изотермы сжатия двух систем. В работе использовали ванну Ленгмюра – Блоджетт с двумя барьерами марки LBXD-MT. Изотермы представлены на рис. 12, 13.

Стандартная изотерма

Полученные изотермы соответствуют начальному участку стандартной изотермы, представленной на рис. 14.

Изначально в системе происходит переориентация молекулы, а затем увеличивается ориентационный порядок молекулы. Для нанесения мономолекулярного слоя на подложку используют концентрации до точки С.

Используя литературные данные, можно предположить, что в этой области концентраций молекулы вертикально ориентированы и это соответствует состоянию жидких растянутых переходящих в жидкие конденсированные пленки. Так же удалось определить давление коллапса в системе желатин – пероксидаза – фосфатный буфер/воздух – 18,48 мН·м^-1, что соответствует литературным данным.

Уравнение определение активности

Единицей удельной активности является количество окисленного субстрата (мкМ), кaтaлизированного 1 г ферментного препaрата (пероксидазa иммобилизовaннaя на желaтине) на протяжении 10 минут.

А (активность)= ;                    (15)

1·=1е.а. 

Активность исследовали после длительного хранения при температуре 4°С в пластиковых герметичных пакетах.

Выводы

Таким образом, в ходе исследования было установлено, что желатин при рН в ИЭТ и выше неё является ПАВом; по изотерме сжатия определили, что системы I, II представляется собой жидкие конденсированные пленки, а при введении пероксидазы понижается давление коллапса; на основе литературных и экспериментальных данных сделали предположение о том, то ферментполиэлектролитные монослои будут проявлять высокую активность относительно гидрохинона. Более подробные выводы представлены на сайде. Разрешите их не зачитывать. Спасибо за внимание.

1.     В ходе работы мы показали, что при рН в изоэлектрической точке (5,3) и выше неё желатин является поверхностно-активным веществом;

2.     По данным ИК-спектроскопии и изменению поверхностной активности доказали, что возможно образование ферментполиэлекролитных комплексов в растворе желатина; 

3.     Были сняты изотермы сжатия в поверхностном слое и установлено, что система представляет собой жидкие конденсированные пленки, а введение в них пероксидазы понижает давление коллапса;

4.     Показано, что желатиновые пленки являются консервантом для пероксидазы и проявляют высокую активность относительно гидрохинона, что позволяет предположить аналогичное действие ферментполиэлектролитных монослоев.

Краткое описание документа:

Существует огромное количество разнообразных нанотехнологий, которые похожи тем, что есть возможность манипулировать объектами с наноразмерами.

На сегодняшний день широкое применение нашли наноматериалы в виде наноплёнок. Наноплёнки – это упорядоченные структуры, которые обладают уникальными электрическими, магнитными и оптическими свойствами. Ленгмюровские плёнки – это стопки монослоёв поверхностно-активных веществ, которых переносят с поверхности воды на твёрдую подложку. Ленгмюровские плёнки создают в том числе на основе белков - глобулярных или фибриллярных. Многие ферменты относятся к глобулярным белкам, а желатин – к фибриллярным. Поэтому актуальной проблемой является конструирование плёнок на основе белков для создания каталитических систем и биосенсоров.