ВАРИАЦИЯ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ДОЛГОЖИВУЩИХ КУЛЬТУРАХ ТКАНЕЙ КИТАЙСКОГО ЖЕНЬШЕНЯ ( PANAX GINSENG CA MEY.)

Вариация нуклеотидной последовательности в долгоживущих культурах тканей китайского женьшеня ( Panax ginseng CA Mey.)

Ситонг Лю

Синьфэн Ван

Нин Дин

Растения обладают выдающимся биологическим свойством тотипотентности, т. е. способностью регенерировать целое растение практически из любого вида полностью дифференцированных соматических клеток после процесса дедифференцировки. Это свойство хорошо задокументировано успешной регенерацией растений из культур тканей различных видов растений. Однако накопление сомаклональных вариаций, особенно изменений кариотипа, в процессе культивирования тканей ставит под угрозу тотипотентность клеток. В этом отношении китайский женьшень ( Panax ginsengCA Mey.) является исключением в том смысле, что он демонстрирует незначительное снижение тотипотентности клеток, сопровождающееся замечательной хромосомной стабильностью даже после длительного культивирования тканей. Однако остается неясным, обязательно ли сочетается стабильность на хромосомном уровне с молекулярно-генетической стабильностью на уровне нуклеотидной последовательности, учитывая, что два типа стабильности генерируются в значительной степени разными механизмами. Здесь мы рассмотрели эту проблему путем полногеномных сравнений при разрешении по одному основанию регенерированного P. ginseng , регенерированного в долгосрочной культуре тканей.растения. Мы идентифицировали многочисленные однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), которые накапливаются в каллусе культивируемого женьшеня и сохраняются в процессе регенерации растений. Эти SNP не возникали случайно, а демонстрировали различия между хромосомами и предвзятую региональную агрегацию вдоль данной хромосомы. Кроме того, наши результаты показывают, что по сравнению с генами в целом, гены, связанные с процессами клеточной тотипотентности и хромосомной стабильности, имеют более низкую частоту мутаций как в кодирующих, так и в фланкирующих областях. Кроме того, в совокупности мутантные гены демонстрируют более высокие уровни экспрессии, чем немутированные гены, и значительно активнее участвуют в фундаментальных биологических процессах, включая организацию, развитие и размножение клеточных компонентов.P. ginseng , вероятно, подвергается селекции для усиления нормального развития. Как таковые, они, вероятно, не подорвали хромосомную стабильность и тотипотентность долгосрочных культур женьшеня.

Ключевые слова: тотипотентность клеток ; стабильность хромосом ; изменение последовательности нуклеотидов ; полногеномное ресеквенирование ; культура тканей ; женьшень

1. Введение

Растения сидячие по своей природе и развили сложную пластичность развития и фенотипа, чтобы адаптироваться к новым и изменяющимся условиям [ 1 ]. Возможно, одним из наиболее примечательных аспектов этой адаптации является тотипотентность, относящаяся к способности полностью дифференцированных соматических клеток растений регенерировать в интактное растение после процесса дедифференцировки [ 2 , 3 , 4 , 5 ]. За последние десятилетия клеточная тотипотентность культивируемых растительных клеток была широко задокументирована у различных видов растений [ 6 , 7 , 8 ].]. Тем не менее, клеточная тотипотентность культивируемых растительных клеток часто быстро снижается со временем в культуре и часто полностью теряет признак в течение 1-2 лет [ 9 ]. Механизмы, лежащие в основе этого явления, не совсем понятны, но одним из предполагаемых виновников является нарушение нормального клеточного контроля во время культивирования, что приводит к возникновению и накоплению нестабильности генома, особенно хромосомной нестабильности (CIN) [ 10 , 11 ].

CIN включает в себя два основных аспекта: числовой и структурный. Числовая CIN относится к потере и/или увеличению целых хромосом или хромосомных сегментов, в то время как структурная CIN относится к транслокации, инверсии и микроскопически видимому увеличению и/или потере сегментов [ 12 ]. Предположительно CIN, являясь скачкообразными изменениями кариотипа, может нарушать любые биологические свойства, особенно сложные (например, тотипотентность клеток), которые влекут за собой сложную регуляцию многими генами на уровне путей и сетей [ 11 ].]. Поэтому неудивительно, что появление и накопление CIN подрывает тотипотентность или полностью ее отменяет. Напротив, большинство мутаций молекулярного уровня, таких как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), являются нейтральными, учитывая, что лишь небольшой процент ядерной ДНК любого высшего эукариотического организма представляет собой гены, кодирующие белок, и даже в которых существует механизм вырождение кодонов или существенные различия в функциональном значении наряду с открытой рамкой считывания. Более того, известно, что два типа стабильности генома, хромосомная и молекулярная, контролируются разными механизмами [ 13 , 14 ].]. В совокупности разумно предположить, что CIN не обязательно связана с генетической нестабильностью на молекулярном уровне, и последняя, ​​если вообще влияет на тотипотентность, должна делать это с гораздо меньшей вероятностью.

Китайский женьшень ( Panax ginseng CA Meyer ) представляет собой многолетнее травянистое растение рода Panax L. семейства Araliaceae [ 15 , 16 ]. Выводы молекулярной филогении и эволюционной истории выявили недавнюю дупликацию всего генома (WGD), которая произошла примерно 2–3 миллиона лет назад, что привело к образованию предкового тетраплоида (2n = 4 x = 48) с последующим разделением на три родственные группы. видов, а именно P. ginseng , P. japonicus и P. quinquefolius [ 17 , 18]. В Восточной Азии китайский женьшень широко используется в качестве традиционной фитотерапии для якобы восстановления выносливости и повышения способности справляться с усталостью и физическим стрессом в течение более 2000 лет [ 19 , 20 ]. Недавние исследования китайского женьшеня также продемонстрировали его фармакологические эффекты при лечении некоторых видов рака, диабета, сердечно-сосудистых заболеваний и дисфункции центральной нервной системы [ 21 , 22 ].

Помимо своего лечебного и медицинского значения, женьшень также обладает рядом важных биологических свойств. Один из них, обнаруженный нами недавно [ 23 ], — это сохранение тотипотентности в течение длительных культур тканей, сопровождающееся высокой хромосомной стабильностью — оба признака неизвестны ни у одного другого растения. В частности, мы обнаружили, что каллюс китайского женьшеня, пересеваемый в течение 12 лет подряд, оставался хромосомно стабильным и демонстрировал незначительное снижение тотипотентности клеток [ 23 ]. Дальнейшие транскриптомные анализы позволили предположить, что устойчивая высокая экспрессия генов, связанных с тотипотентностью тканей и хромосомной стабильностью, может быть связана с проявлением этих двух признаков [ 23 ].]. Тем не менее, несколько предыдущих исследований показали, что в культурах тканей женьшеня проявляются мутации на уровне нуклеотидной последовательности. Например, Киселев и др. (2013) проанализировали четыре функционально важных гена в двух- и 20-летних культурах женьшеня и обнаружили, что все четыре гена демонстрируют нуклеотидную изменчивость, которая накапливается с продолжительностью выращивания [ 24 , 25 ]. Эти исследования, хотя и основанные только на нескольких предварительно отобранных генах, предполагают, что с точки зрения генетической изменчивости на молекулярном уровне в культуре тканей женьшень, возможно, не сильно отличается от других растений. Тем не менее, чтобы получить окончательный ответ на этот вопрос, необходимы полногеномные анализы, которых в настоящее время не хватает.

Здесь мы рассмотрели этот вопрос на основе результатов, полученных в нашем предыдущем исследовании [ 23 ]. В частности, мы выполнили полногеномное повторное секвенирование и провели полногеномный анализ с разрешением по одному основанию для генетических вариаций на молекулярном уровне у растений, регенерированных из длительно культивируемых каллусов, которые все еще были высоко тотипотентными и показывали небольшой CIN [ 23 ]. Мы охарактеризовали SNP в отношении их отношения к геномным особенностям, хромосомному распределению, категории генов и экспрессии. Мы пришли к выводу, что генетическая изменчивость на молекулярном уровне имела место в пролонгированных культурах тканей P. ginseng и сохранялась в регенерированных растениях. Однако эти мутации на молекулярном уровне, возможно, не повлияли на хромосомную стабильность и тотипотентность.

2. Методы и материалы

2.1. Растительные материалы и культура каллуса

Исходный эксплантат женьшеня был взят из одной почки P. ginseng cv. Дамая в 2004 году [ 23 ]. Первичный каллус индуцировали стандартной твердой средой Мурасиге-Скуга (МС), содержащей 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D), при 26 °C в темных условиях в течение 1 месяца. Затем отбирали новообразованные эмбриогенные каллусы и пересевали на среду МС в тех же условиях (с 30-дневным интервалом) в течение 12–13 лет [ 23 ]. Эмбриогенные каллусы оставались тотипотентными, и в 2016 и 2017 гг. их перенесли на среду для регенерации, содержащую МС базаль + 0,3 % гидролизованной казеиновой кислоты + 0,1 % пролина + 1 мг/л 2,4-Д, и культивировали при 26 °С в течение 14 лет. /10 свет/темнота [ 26]. Регенерированные проростки женьшеня брали для последующих экспериментов.

2.2. Экстракция ДНК и полногеномное ресеквенирование

Первая партия образцов включала 20 случайно выбранных проростков женьшеня, регенерированных из 12-летних каллусов женьшеня, которые были произвольно разделены на два пула. Второй участок образца включал семь регенерированных проростков из 13-летних каллусов женьшеня. Экстракцию ДНК из трех объединенных образцов проводили с использованием модифицированного метода CTAB [ 27 ]. Высококачественная геномная ДНК каждого образца использовалась для последующего ресеквенирования всего генома. Библиотеки ДНК с короткими концами (150 п.н.) трех образцов были сконструированы с помощью набора Illumina Trueseq DNA PCR-Free в Novogene (Тяньцзинь, Китай) и секвенированы с помощью платформы Illumina Hi-seq 4000 (Illumina, Калифорния, США). Данные были размещены в базе данных SRA GenBank ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra )., по состоянию на 20 ноября 2021 г.) с регистрационным номером BioProject PRJNA782439. Только чистые чтения (базовое качество> 30) были сохранены для последующего анализа данных.

2.3. Идентификация генетических вариантов De Novo и их хромосомное распределение

Чтобы идентифицировать генетические варианты, накопленные в этих образцах растений, регенерированных культурой ткани, чистые короткие чтения трех объединенных образцов были сопоставлены с эталонным геномом P. ginseng с использованием выравнивателя Burrows-Wheeler (BWA) [ 28 ] с параметрами по умолчанию. Затем были использованы программа Samtools [ 29 ], набор инструментов для анализа генома (GATK) [ 30 ] и программа Picard ( http://broadinstitute.github.io/picard/ , по состоянию на 19 ноября 2021 г.) для сортировки, индексации и повторного выравнивания сопоставили короткие чтения и удалили дубликаты. Чтобы идентифицировать SNP с высокой степенью достоверности, повторно выровненные короткие чтения были дополнительно отфильтрованы с использованием программы Bcftools [ 29 ].], с параметрами «-a DP,ADF,ADR -Q 30 -q 30 -Ou». SNP низкого качества с базовым качеством (Q) или качеством картирования (q) менее 30 были исключены из анализа данных. Кроме того, мы провели дополнительный контроль качества SNP в соответствии со следующими процедурами: (1) каждый аллель гетерозиготных (Ht) SNP имеет > пяти картированных прочтений; (2) сохранялись гомозиготные (Но) SNP с глубиной чтения ≥5; (3) SNP с мультиаллельными (≥3) вариантами, инсерциями и делециями были исключены. Только те SNP, которые прошли вышеуказанный контроль качества, использовались для дальнейшего анализа. Основываясь на этих идентифицированных SNP Ht, мы далее определили варианты de novo как те, которые не были общими для трех образцов (y_2016_1, y_2016_2 и y_2017),

2.4. Функциональный анализ мутировавших генов

Программа SnpEff [ 31 ] использовалась для независимого аннотирования идентифицированных SNP из трех объединенных образцов. Затем мы подсчитали количество несинонимичных (Sn) и синонимичных (Ss) мутаций для каждого гена. На основании этой аннотированной информации все гены были разделены на две категории, а именно мутировавшие гены (содержащие SNP) и немутированные гены (без SNP). Мутированный ген был дополнительно разделен на два типа: ген Sn (содержащий мутации Sn) и другой тип (без мутаций Sn). Функции генов в разных классах были проанализированы и сделаны выводы с использованием WEGO 2.0 (график аннотаций веб-генной онтологии, http://wego.genomics.org.cn/ , по состоянию на 21 ноября 2021 г.) [ 32 ].]. Данные об экспрессии генов и геномная структура генов в разных классах были получены из нашего предыдущего исследования [ 23 ]. Паттерны распределения идентифицированных SNP визуализировали с помощью пакета R «ggplots» и «RColorBrewer». Корреляцию между мутацией гена и уровнем экспрессии анализировали в пакете R «ggplots».

3. Результаты

3.1. Идентификация генетических мутаций на молекулярном уровне в проростках женьшеня, регенерированных из многолетнего каллуса

Полногеномное повторное секвенирование трех объединенных образцов проростков, регенерированных каллюсом женьшеня, дало в общей сложности 1 638 664 104 чистых парных концевых прочтений Illumina (длина прочтений = 150 п.н.), при этом каждый образец обладал 36-58-кратным охватом генома ( Таблица S1 ). Основываясь на этих данных глубокого секвенирования, мы идентифицировали в общей сложности 1 480 353 Ht SNP из трех образцов, каждый из которых содержит от 336 972 до 1 137 450. Среди этих вариантов нуклеотидов 343 330 были общими для всех трех образцов ( таблица 1 ).). Учитывая, что (1) растения женьшеня известны как генетически гетерогенные среди особей даже в пределах одного и того же сорта (например, Damaya), и (2) у нас больше не было точного экземпляра растения (в качестве контроля), от которого был взят эксплантат для инициировать культуры каллуса, мы определили SNP, общие для всех трех образцов, как постоянные генетические различия между нашим эксплантатом и эталонным геномом женьшеня. Таким образом, только 1 137 023 Ht SNP, которые не являются общими для трех образцов, были определены как варианты de novo, возникшие в процессе культивирования каллуса и сохранившиеся в регенерированных проростках ( таблица 1 ).). Хотя в некоторой степени это консервативное лечение может привести к недооценке вариаций, вызванных культурой, оно надежно исключает ложноположительные результаты. Хотя потенциал недооценен, наши данные ясно показывают, что сомаклональные вариации в форме SNP окончательно произошли в каллусах женьшеня, культивируемых в течение длительного времени.

Таблица 1. Количество гетерозиготных (Ht) генетических вариантов и разнообразие нуклеотидов в трех объединенных каллусно-регенерированных проростках женьшеня обыкновенного .

Затем мы спросили, как эти генетические варианты de novo были связаны с геномными особенностями в геноме женьшеня. На уровне всего генома образец y_2017 (0,34 Ht/Kb) содержал более высокое разнообразие нуклеотидов по сравнению с двумя образцами y_2016 (0,18 и 0,10 Ht/Kb). В области гена все три образца показали несколько более низкое разнообразие нуклеотидов (0,09–0,26 Ht/Kb) по сравнению с уровнем всего генома. Примечательно, что гены, связанные с тотипотентностью клеток (0,06–0,16 Ht/Kb) и хромосомной стабильностью, обладают явно более низким разнообразием нуклеотидов в генных областях по сравнению с генными областями в целом по всему геному. Мы также подсчитали количество мутаций Ss и Sn в трех образцах ( таблица S2 ).). Общая закономерность заключается в том, что все три образца содержали больше Sn, чем Ss мутаций для общих генов и генов, связанных с тотипотентностью/хромосомной стабильностью. Среди трех образцов образец y_2017 (Ss = 8666 и Sn = 16 806) содержал большее количество мутаций Ss и Sn по сравнению с двумя образцами каллуса y_2016 (Ss = 3851–6699 и Sn = 7271–12 691) для общих генов. Аналогичным образом, мы также идентифицировали меньшее количество мутаций Ss и Sn в генах, связанных с тотипотентностью клеток (Ss = 3,95–15,30 × 10–6 и Sn = 9,37–25,20 × 10–6 ) и генах, связанных со стабильностью хромосом (Ss = 8,62). –24,80 × 10–6 и Sn = 13,90–45,60 × 10–6 ), чем у суммарных генов (Ss = 12,10–27,10 × 10–6 и Sn = 22,80–52,60 × 10) .−6 ).

3.2. Спектр и тренд генетических мутаций на молекулярном уровне

Приведенный выше анализ выявил разные уровни нуклеотидного разнообразия среди трех образцов проростков, регенерированных каллюсом женьшеня, и различия в разных геномных областях. Затем мы рассчитали спектр генетических вариантов вдоль 24 хромосом женьшеня ( рис. 1 ).). Результаты показали, что эти генетические варианты не были случайным образом распределены по данной хромосоме женьшеня, и количество мутаций различалось между хромосомами. Например, каждая из 24 хромосом содержала несколько геномных областей с высоким уровнем мутаций (называемых кластерами мутаций) в трех образцах. Кроме того, некоторые хромосомы (например, Chr06) содержат больше кластеров мутаций, чем другие (например, Chr24). В частности, все гомеологичные пары хромосом двух субгеномов различались по количеству и характеру распределения мутационных кластеров. В целом, все три образца показали сходные модели распределения кластеров мутаций вдоль 24 хромосом.

Рисунок 1. Геномный/хромосомный ландшафт генетических вариантов, идентифицированных в трех объединенных образцах проростков, регенерированных каллюсом женьшеня. Четыре строки сверху вниз для каждой хромосомы представляют собой генетические варианты, идентифицированные в образцах y_2016_1, y_2016_2, y_2017 и генетические варианты de novo. Номера четырех типов Ht SNP такие же, как в таблице 1 . Гомеологичные хромосомы двух субгеномов женьшеня помечены синим и красным цветом соответственно.

Затем мы оценили спектр мутаций Ss и Sn отдельно вдоль каждой хромосомы трех образцов ( рис. S1 ). Подобно спектру мутаций на общем уровне, варианты Ss и Sn также демонстрировали различные модели вариаций на 24 хромосомах. Например, как количество, так и распределение кластеров мутаций различались между мутациями Ss и Sn внутри и между 24 хромосомами. Кроме того, наши результаты также показали, что кластеры мутаций имеют тенденцию к телеметрическим областям ( рис. S1 ). Однако для общих генетических вариантов наблюдалась противоположная картина распределения (см. Рисунок 1 ).). Примечательно, что, хотя три образца показали очень похожий общий характер распределения этих генетических вариантов, они обладали некоторыми характерными для образца мутационными кластерами всех трех типов генетических вариантов (в целом, Ss и Sn), особенно в центромерной области. из Хр06.

3.3. Ассоциации между генетической изменчивостью и экспрессией генов

Приведенный выше анализ выявил кластерное распределение генетических вариантов. Затем мы исследовали, будут ли мутированные гены демонстрировать разные уровни транскрипции по сравнению с немутированными генами (дикого типа). Общая картина, наблюдаемая на общем уровне, заключалась в том, что гены, локализованные в дистальных (субтеломерных) областях, демонстрировали более высокие уровни экспрессии по сравнению с генами в интерстициальных (перицентромерных) областях, хотя каждая из 24 хромосом демонстрировала разные общие уровни транскрипции ( рис. 2 ).а). Между двумя субгеномами 12 гомеологичных пар хромосом обладают очень сходным паттерном экспрессии в дистальных областях. Например, гены, локализованные в двух дистальных геномных регионах гомологичной пары хромосом 1 и 9, показали различные уровни транскрипции. Дальнейший анализ взаимосвязи между транскрипцией генов и генетическими вариантами показал, что мутантные гены обладают более высокими уровнями транскрипции, чем немутированные (т.е. гены дикого типа) во всех трех образцах ( рис . 2b). Кроме того, мутированные гены, содержащие несинонимичные мутации, показали относительно более высокие уровни экспрессии по сравнению с генами с синонимичными мутациями, хотя оба они показали более высокие уровни транскрипции по сравнению с немутированными генами.

Рисунок 2. Полногеномный паттерн экспрессии генов и корреляция с генетической мутацией. ( а ) Уровень транскрипции всех генов вдоль каждой из 24 хромосом. Две строки для каждой хромосомы соответствуют выборке y_2016_1 и y_2016_2 соответственно; ( б ) сравнения между общими уровнями экспрессии генов и типами генетических вариантов.

3.4. Функциональное обогащение мутировавших генов

Все генетические варианты, идентифицированные в трех образцах регенерированных проростков, должны были возникнуть в процессе пересева каллуса. Затем мы задали вопрос: были ли эти мутировавшие гены функционально связаны со стабильностью хромосом и тотипотентностью клеток? Функциональный анализ обогащения показал, что гены, связанные с тотипотентностью и стабильностью хромосом, демонстрируют различные модели обогащения по сравнению с общими генами ( рис. 3 ).). На уровне клеточного компонента, например, по сравнению с генами, связанными с тотипотентностью клеток, и общими генами, гены, связанные со стабильностью хромосом, показали относительно более высокое обогащение терминами генной онтологии (GO), относящимися к внутриклеточной клетке, части органеллы и надмолекулярному комплексу. . Аналогичная картина также наблюдалась на уровне молекулярной функции, где гены, связанные со стабильностью хромосом, демонстрировали более высокое обогащение белковой активностью, связыванием молекулярных и химических соединений. Однако в биологическом процессе гены, связанные с тотипотентностью клеток, демонстрируют более высокий процент обогащения этими терминами GO, участвующими в различных метаболических процессах, развитии растений и реакциях на стресс.

Рисунок 3. Анализ обогащения GO всех генов, связанных с тотипотентностью и стабильностью хромосом. Обогащенные термины ГО в клеточном компоненте ( а , г ), биологическом процессе ( б , д ) и молекулярной функции суммарных генов ( в , е ), генов тотипотентности и генов стабильности хромосом.

Основываясь на приведенном выше функциональном анализе на общем уровне, мы дополнительно исследовали, существовал ли аналогичный паттерн обогащения в мутировавших генах. Наши результаты показали, что мутировавшие гены трех образцов показали различное обогащение терминов GO по сравнению с генами в целом, как подробно описано выше ( рис. S2–S4 ).). В категории клеточного компонента мутантные гены образца y_2016_1 демонстрировали схему обогащения, аналогичную общим генам, при этом большинство терминов обогащения GO относились к внутриклеточной части клетки и органеллы. Однако два других образца (y_2016_2 и y_2017) были обогащены другими клеточными компонентами, такими как мембранная часть и надмолекулярный комплекс. Напротив, три образца демонстрировали умеренные различия в функциональном обогащении в категориях молекулярной функции и биологического процесса. Например, по сравнению с немутированными генами, мутантные гены трех образцов показали функциональное обогащение в биологических процессах, связанных с метаболическим процессом, развитием, репродукцией и реакцией на стресс. В категории молекулярных функций

Примечательно, что мутированные и немутированные гены показали различное функциональное обогащение. В категории клеточных компонентов гены, связанные со стабильностью хромосом, демонстрировали более высокую степень обогащения компонентами, относящимися к внутриклеточным, органелльным и надмолекулярным комплексам ( рис. S2–S4 ).). Однако мутированные гены, содержащие мутации Ss и Sn, демонстрируют более низкую степень функционального обогащения, чем немутированные гены. Тем не менее, мутантные гены обладали подобными обогащенными терминами GO для генов, связанных с тотипотентностью и стабильностью хромосом в категориях биологических процессов и молекулярных функций. Синонимичные и несинонимичные гены показали более высокую степень обогащения, чем немутированные гены, особенно те, которые связаны с организацией клеточных компонентов, развитием растений и репродукцией. Кроме того, мы также исследовали типы мутаций для генов, связанных с тотипотентностью и стабильностью хромосом. Общая закономерность заключалась в том, что большинство этих важных функциональных генов обладали множественными копиями в геноме женьшеня ( таблица S3 ).). Например, 108 из 388 генов, связанных с тотипотентностью клеток, были функционально связаны с переносчиком оттока ауксина и реакцией в геноме женьшеня ( таблица S4 ). Аналогичным образом, мы также идентифицировали 88 казеинкиназ 1 (CK1) и 102 CGMC (CGMC включает киназы CDA, MAPK, GSK3 и CLKC) в 533 генах, связанных со стабильностью хромосом ( таблица S5 ). Примечательно, что среди 388 генов, связанных с тотипотентностью клеток, некоторые функционально важные гены обладали как мутациями Sn, так и Ss, в том числе участвующими в ауксиновом ответе и метилировании ДНК. Точно так же мы также идентифицировали мутации Sn и Ss в некоторых из 533 генов, связанных со стабильностью хромосом, таких как dnaK, субъединица поддержания минихромосомы 2/3 (MCM2/3) и CK1.

4. Обсуждение

Растения в целом обладают большей способностью к регенерации новых тканей и органов при утрате или повреждении частей тела в естественных условиях, чем животные [ 33 , 34 , 35 ]. Эксперименты с культурами тканей растений in vitro выявили еще более замечательное свойство растений, а именно тотипотентность, относящуюся к феномену, когда полностью дифференцированные соматические клетки растений способны повторно дифференцироваться в интактные растения после фазы дедифференцировки [ 36 , 37 , 38 , 39 ]. Однако во время культивирования тканей различные генетические и эпигенетические нестабильности (собирательно называемые сомаклональными вариациями [ 10]), которые, с одной стороны, могут включать в себя элитные фенотипы растений-доноров, а с другой стороны, могут быть использованы для полезных вариантов [ 9 , 13 ]. В то время как эпигенетическая изменчивость, индуцированная тканевой культурой, в основном включает изменения в метилировании ДНК, т. е. потерю/приобретение метилированных цитозиновых оснований [ 40 ], генетическая изменчивость более сложна и может быть широко классифицирована как мутации на хромосомном уровне и уровне последовательности [ 41 ]. Принято считать, что сомаклональная изменчивость является основной причиной быстрого снижения и/или потери тотипотентности в культурах тканей растений [ 42 ].

Недавно мы сообщили, что, в отличие от других видов растений, культивируемая линия сомаклонального каллуса женьшеня показала незначительное снижение тотипотентности даже после более чем 12 лет субкультивирования [ 23 ]. Следует отметить, что наше исследование показало, что эта линия сомаклонального каллуса женьшеня сохраняет высокую хромосомную стабильность как по количеству, так и по структуре. Насколько нам известно, эти два свойства P. ginseng не наблюдались ни у каких животных (в отношении соматической хромосомной стабильности) и других растений. Однако предыдущие исследования показали, что мутации на уровне нуклеотидной последовательности происходили в культурах тканей женьшеня, при этом частота мутаций увеличивалась в зависимости от времени [ 24 , 25 ].]. Таким образом, кажется, что женьшень не особенно отличался от других растений в этом аспекте, что не соответствует нашим результатам [ 23 ]. Однако известно, что хромосомные и нуклеотидные нестабильности контролируются разными путями [ 13 , 14 , 43 ]. Следовательно, возможно, что мутации на уровне последовательности также происходили в изученной нами сомаклональной линии каллуса [ 23 ], что не нарушало тотипотентность. Если бы это было так, было бы также интересно узнать, какие особенности имеют эти мутации.

Здесь мы исследовали этот вопрос на основе полногеномного повторного секвенирования и анализа проростков женьшеня, регенерированных из той же линии соматического каллуса, которые показали замечательную хромосомную стабильность [ 23 ].]. Мы обнаружили многочисленные генетические варианты на уровне нуклеотидной последовательности, хотя мы приняли высококонсервативную обработку данных, то есть исключили варианты, которые являются общими для всех трех образцов, каждый из которых содержит пул регенерированных проростков (см. Результаты). Мы обнаружили несколько особенностей этих мутаций, в том числе (i) появление кластеров мутаций и их смещенное распределение в сторону дистальных областей хромосом; (ii) более высокая частота несинонимичных, чем синонимичных мутаций; (iii) более низкая частота мутаций в генах, связанных с тотипотентностью и стабильностью хромосом, чем в генах в целом; (iv) более высокие уровни экспрессии в мутированных генах, чем в немутированных генах; и (v) обогащение мутантных генов ключевыми базовыми биологическими процессами, включая организацию, развитие и размножение клеточных компонентов.

Примечательно, что поскольку мы анализировали регенерированные проростки, а не каллюс как таковой, обнаруженные нами мутации должны составлять небольшую долю тех, которые произошли в каллюсе и которые были сохранены в процессе регенерации. Таким образом, нет никаких сомнений в том, что мутации на уровне нуклеотидной последовательности действительно происходили в культивируемых клетках женьшеня, что согласуется с предыдущими исследованиями [ 24 , 25 ]. Особенности, которые мы суммировали выше, могут свидетельствовать о том, что мутации в наших многолетних культурах женьшеня не происходили случайно. Более того, они, вероятно, находились как под очищающим, так и под положительным отбором. Во-первых, потому что дистальные участки хромосом известны как рекомбинационно-активные, если события соматической рекомбинации [ 44] произошли в процессе длительного культивирования, то возможно, что вредные мутации могут быть удалены. Во-вторых, как более высокая частота несинонимичных, чем синонимичных мутаций, так и более высокие уровни экспрессии мутированных, чем немутированных генов, предполагают возможность отбора. В-третьих, более низкая, чем в среднем, частота мутаций в генах, связанных с тотипотентностью клеток и хромосомной стабильностью, предполагает либо неслучайное возникновение мутации, либо более эффективную репарацию этих критических генов. Наконец, специфическое обогащение мутантных генов фундаментальными биологическими процессами может указывать на их потенциальную компенсаторную роль в поддержании критического клеточного гомеостаза и в укреплении нормального развития. Вместе, эти особенности мутаций, которые мы обнаружили в долговременных культурах женьшеня, убедительно свидетельствуют о том, что они не подрывали хромосомную стабильность и не подвергали тотипотентности клеток. Например, несколько генов, связанных с ответом на ауксин, т.е. фактор ответа на ауксин 19 и компонент переносчика оттока ауксина, обладают многочисленными несинонимичными мутациями. Было документально подтверждено, что гены, участвующие в биосинтезе ауксинов и цитокининов, играют важную роль в клеточной тотипотентности культивируемых растительных клеток.1 , 34 ]. Это говорит о том, что эти генетические мутации потенциально связаны с поддержанием тотипотентности клеток в долгосрочном процессе культивирования тканей.