Современные методы исследования БАС

• 1 слайд

  Современные методы исследования БАС
  Методы выделения и анализа. Лекция 2
  

• 2 слайд

  Буферные растворы
  Буферные растворы - это растворы, концентрация ионов водорода (рН) которых не изменяется от прибавления ограниченных количеств сильной кислоты или щелочи.
  
  Основные типы:
  Слабая кислота и ее анион А- /НА
  Слабое основание  и его катион В/ВН+
  Анионы кислой и средней соли или двух кислых солей
  Ионы и молекулы амфолитов
  

• 3 слайд

  pH – водородный показатель
  pH (произносится «пэ аш», английское произношение англ. pH — piː'eɪtʃ «Пи эйч») - мера активности (в очень разбавленных растворах она эквивалентна концентрации) ионов водорода в растворе, и количественно выражающая его кислотность,
  вычисляется как отрицательный (взятый с обратным знаком) десятичный логарифм активности водородных ионов, выраженной в молях на литр:
  pH = - lg[H+]
  
  В чистой воде при 22 °C концентрации ионов водорода ([H+]) и гидроксид-ионов ([OH−]) одинаковы и составляют 10−7 моль/л, это напрямую следует из определения ионного произведения воды, которое равно [H+] · [OH−] и составляет 10−14 моль²/л² (при 22 °C).
  Вопреки распространённому мнению, pH может изменяться не только в интервале от 0 до 14, а может и выходить за эти пределы.
  Например, при концентрации ионов водорода [H+] = 10−15 моль /л, pH = 15, при концентрации ионов гидроксида 10 моль /л pOH = −1.
  
  
  

• 4 слайд

  Измерение pH
  Индикаторы
  pH - метры
  

• 5 слайд

  Уравнение Хендерсона - Хассельбаха
  

• 6 слайд

  Буферная емкость определяется количеством эквивалентов сильной кислоты или основания,
  которые необходимо добавить к 1 л буферного раствора, чтобы изменить его pH на единицу.
  
  

• 7 слайд

  Буферная емкость
  Что происходит с pH при разбавлении буфера?
  Буферная емкость максимальна при
  соотношении кислоты и соли 1:1 => pH = pK.
  
  Хорошая – при [pK+0.5, pK-0.5]
  
  Достаточная – при [pK+1, pK-1]
  
  
  Что происходит с буферной емкостью при разбавлении буфера?
  

• 8 слайд

  Буферная емкость
  Буферная емкость максимальна при
  соотношении кислоты и соли 1:1 => pH = pK.
  
  Хорошая – при [pK+0.5, pK-0.5]
  
  Достаточная – при [pK+1, pK-1]
  
  Чем выше концентрация раствора, тем больше его буферная емкость.
  Концентрация кислоты и соли в буферных растворах обычно бывает порядка 0,05—0,20 М.
  

• 9 слайд

  Требования к буферным растворам
  Обладать достаточной буферной емкостью в требуемом диапазоне значений рН.
  
  Обладать высокой степенью чистоты.
  
  Хорошо растворяться в воде и не проникать через биологиче­ские мембраны.
  
  Обладать устойчивостью к действию ферментов и гидролизу.
  
  рН буферных растворов должен как можно меньше зависеть от их концентрации, температуры и ионного или солевого состава среды.
  
  Не оказывать токсического или ингибирующего действия.
  
  Комплексы буфера с катионами должны быть растворимыми.
  
  Не поглощать свет в видимой или ультрафиолетовой областях спектра.
  
  

• 10 слайд

  Буферные растворы
  Ацетатный, цитратный, боратный
  Аммиачный, ТРИС
  Фосфатный, гидрокарбонатный
  

• 11 слайд

  ТРИС
  Трис (tris) — сокращённое название трис (гидроксиметил) аминометана.
  
  Является главным компонентом буферных растворов, широко применяющихся в биохимии и молекулярной биологии.
  
  Наиболее распространённые буферы на основе триса — TAE (трис — ацетат — ЭДТА) и TBE (трис — борат — ЭДТА).
  
  Трис биологически инертен и не вступает в реакции, катализируемые большинством ферментов.
  
  pKa = 8,6, что позволяет готовить на его основе буферы в диапазоне pH от 7,0 до 9,2. Физиологические значения pH (7,35—7,45) попадают в этот диапазон.
  
  

• 12 слайд

  Использование комбинированных pH электродов.
  Между измерениями рабочая часть электрода должна находиться в буфере для заполнения электрода (обычно: {насыщенный KCl}, {4M KCl насыщенный AgCl}, {1M KCl насыщенный AgCl} и т.п.). Ни в коем случае - не "сухой" и не "в дистилляте"!
  Электрод портится не только из-за измерения в грязных/белковых растворах. Проблемы может вызвать и его высушивание.
  О проблемах с электродом может свидетельствовать медленная установка pH (достижение 95% величины измерения более, чем за 45сек.)
  

• 13 слайд

  Центрифугирование
  Центрифугирование (от центр и лат. fuga — бегство, бег), разделение неоднородных систем под действием центробежных сил.
  Мы имеем дело с жидкостными системами – суспензиями и эмульсиями.
  

• 14 слайд

  Термины и определения
  Диспе́рсная систе́ма — это образования из двух или более числа фаз (тел), которые совершенно или практически не смешиваются и не реагируют друг с другом химически. Первое из веществ (дисперсная фаза) мелко распределено во втором (дисперсионная среда). Если фаз несколько, их можно отделить друг от друга физическим способом (центрифугировать, сепарировать и т. д.).
  
  Эму́льсия (новолат. emulsio, от лат. emulgeo — дою, выдаиваю) — дисперсная система с жидкой дисперсионной средой и жидкой дисперсной фазой. Эмульсии состоят из несмешиваемых жидкостей.
  
  Суспе́нзия, или взвесь (лат. suspensio, буквально — подвешивание, от лат. suspendo — подвешиваю) — смесь веществ, где твёрдое вещество распределено в виде мельчайших частичек в жидком веществе во взвешенном (неосевшем) состоянии. Обычно размер частиц > 10 мкм
  

• 15 слайд

  Термины и определения
  Коллоидные системы (коллоиды, др.-греч. κόλλα — клей и εἶδος — вид; «клеевидные») — дисперсные системы, промежуточные между истинными растворами и грубодисперс-ными системами — взвесями.
  Коллоидные частицы не препятствуют прохождению света.
  В прозрачных коллоидах наблюдается рассеивание светового луча (эффект Тиндаля).
  Дисперсные частицы не выпадают в осадок за счёт броуновского движения.
  
  Золи (нем. sole от лат. solutio — раствор) = коллоидные растворы
  
  Ге́ли (от лат. gelo — «застываю») — структурированные дисперсные системы, состоящие из высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ. Наличие трёхмерного полимерного каркаса (сетки) сообщает гелям механические свойства твёрдых тел - отсутствие текучести, способность сохранять форму, прочность и способность к деформации (пластичность и упругость).
  «гель» — химия, химическая технология, косметические и бытовые средства;
  «желе» — в кулинарии сладкие фруктовые или ягодные студенистые блюда;
  «студень» — в кулинарии мясное или рыбное блюдо из охлажденного мясного (или рыбного) бульона с кусочками мяса (или рыбы)
  
  
  

• 16 слайд

  Центрифугирование.
  Скорость осаждения, или седиментации,зависит от центробежного ускорения (G), прямо пропорционального угловой скорости ротора (ω,в рад/с) и расстоянию между частицей и осью вращения (R, в см): G = ω 2 * R.
  
  Угловая скорость ротора в оборотах в минуту N(об./мин)
  ω = 2πN/60 = πN/30
  
  Центробежное ускорение: G =π 2 * N 2 * R / 900 (об./мин)
  
  Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g и называется относительным центробежным, ускорением
  
  ОЦУ= G / 980 = 1,11*10-5 * N 2 *R
  Что такое g? Чему равно?
  

• 17 слайд

  Закон Стокса, видоизмененный Сведбергом и Никольсом
  время, необходимое для осаждения гомогенных сфери-ческих частиц, обратно пропорционально квадрату их радиусов и разности плотностей частиц и среды и прямо пропорционально вязкости среды!
  

• 18 слайд

  Центрифугирование
  Препаративное
  Аналог фильтрования
  Разделение объектов
  Аналитическое
  Молекулярные веса
  Изучение конформаций макромолекул
  
  

• 19 слайд

  Методы центрифугирования
  Дифференциальное
  Зонально-скоростное
  Изопикническое
  

• 20 слайд

  Дифференциальное центрифугирование
  Можно ли получить чистую фракцию?
  

• 21 слайд

• 22 слайд

  Зонально-скоростное центрифугирование
  

• 23 слайд

  Изопикническое центрифугирование
  Почему формируется градиент плотности?
  

• 24 слайд

  Эксперимент Мезельсона и Сталя
  E. coli в среде, богатой 15N. Затем их ДНК была выделена и центрифугирована в градиенте плотности CsCl.
  Эти бактерии затем были помещены обратно в 14N среду, где им было позволено разделиться только один раз. Затем из клеток были извлечены ДНК, их вес оказался больше веса ДНК бактерий, выращенных в среде, богатой 14N, но меньше веса ДНК бактерий, выращенных в 15N среде
  Было выращено второе поколение бактерий, и их ДНК также было взвешено. Выяснилось, что клетки содержат как полностью «лёгкие» ДНК, так и «гибридные». Этот факт позволил исключить гипотезу дисперсного механизма репликации.
  

• 25 слайд

  Препаративные центрифуги
  Центрифуги общего назначения
  8000 об./мин
  ОЦУ до 6000 g.
  Скоростные центрифуги
  25 000 об/мин
  ОЦУ до 89 000 g
  Препаративные ультрацентрифуги
  75 000 об./мин
  ОЦУ до 510 000 g
  
  

• 26 слайд

  Центрифуги общего назначения
  Угловые роторы и роторы с подвесными стаканами
  УРАВНОВЕШИВАНИЕ И СИММЕТРИЯ!
  

• 27 слайд

  Скоростные центрифуги
  Роторы обоих типов, но!
  Обязательно охлаждение
  Броня
  Гибкая подвеска ротора
  Автоматика
  
  

• 28 слайд

  Ультрацентрифуги
  Угловые роторы
  Обязательно охлаждение
  Вакуум
  Броня
  Гибкая или струнная подвес-ка ротора
  Автоматика
  
  

• 29 слайд

  Аналитические ультрацентрифуги
  Идея ультраценрифугирования была предложена А.В. Думанским в 1913, однако разработка современной теории седиментационного анализа стала возможной только после того, как Т. Сведберг в 1926 сконструировал высокоскоростную ультрацентрифугу. 41000 об/мин, ускорения — до 105 g
  Подвеска на струне, газовая турбина, вакуум, холод, броня, оптическая система
  УРАВНОВЕШИВАНИЕ И СИММЕТРИЯ!
  

• 30 слайд

  Определение молекулярных весов
  По скорости седиментации
  Метод седиментационного равновесия
  Метод приближения к седиментацион-ному равновесию
  

• 31 слайд

  По скорости седиментации
  Константа седиментации это скорость, отнесенная к еди¬нице ускорения, имеет размерность времени (ее выражают в секундах).
  
  Величина константы седиментации, равная 1•10–13 с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S).
  
  Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах 1–50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S.
  
  Молекулярный вес молекул определяют по уравнению Сведберга
  
  
  
  
  М — молекулярный вес молекулы, R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, s — коэффициент седиментации молекулы, D — коэффициент диффузии молекулы, v — парциальный удельный объем, который можно рассматривать как объем, занимаемый одним граммом растворенного вещества, р — плотность растворителя.
  
  
  
  

• 32 слайд

  Метод седиментационного равновесия
  Ультрацентрифугирование проводят вплоть до достижения частицами равновесия, устанавливающегося под действием центробежных сил, с одной стороны, и диффузионных — с другой, т. е. до тех пор, пока частицы не перестанут перемещаться. Затем по образовавшемуся градиенту концентрации рассчитывают молекулярный вес вещества 'согласно формуле
  
  
  
  
  R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, ю — угловая скорость, р — плотность растворителя, v — парциальный удельный объем, сх и с2— концентрация растворенного вещества на расстояниях гг и г2 от оси вращения
  
  Недостатком данного метода является то, что для достижения седиментациоиного равновесия необходимо длительное время — от нескольких дней до нескольких недель при непрерывной работе центрифуги.
  
  
  
  

• 33 слайд

  Метод приближения к седиментационному равновесию
  Этот метод был разработан для того, чтобы избавиться от недостатков предыдущего метода, связанных с большими затратами времени, необходимого для установления равновесия.
  С помощью него можно определять молекулярные веса, когда центрифугируемый раствор находится в состоянии приближения к равновесию.
  Вначале макро­молекулы распределяются по всему объему аналитической ячейки равномерно; затем по мере центрифугирования молекулы оседают, и плотность раствора в области мениска постепенно уменьшается.
  Изменение плотности тщательно регистрируют, а затем путем слож­ных расчетов, включающих большое число переменных, определяют молекулярный вес данного соединения по формулам.
  
  
  
  

• 34 слайд

  Методы формирования градиента
  Ступенчатый градиент
  Сообщающиеся сосуды
  Перистальтический насос
  Системы формирования градиента
  

• 35 слайд

  Градиент с помощью сообщающихся сосудов
  

• 36 слайд

  Градиент с помощью перистальтического насоса
  

• 37 слайд

  Перистальтический насос
  Насос для перекачки жидкостей, текущих по гибким трубкам.
  Принцип действия основан на том, что ролики передавливают трубку с жидкостью, и двигаясь вдоль трубки, проталкивают жидкость вперёд.
  Обычно состоит из гибкой трубки, нескольких роликов, и поверхности (трека), к которой ролики прижимают трубку
  

• 38 слайд

  Перистальтические насосы - достоинства
  Среда и насос не взаимодействуют
  Агрессивная среда
  Чувствительные объекты
  
  Точность и неизменность дозирования ± 0,5 %
  
  Отсутствие пульсаций
  
  Широкий диапазон скоростей – зависит от трубки
  
  Параллельная перекачка
  
  Простота конструкции
  

• 39 слайд

  Перистальтические насосы - недостатки
  Низкое рабочее давление
  
  Иногда трудно подобрать материал трубок
  

• 40 слайд

  Перистальтические насосы
  

• 41 слайд

  Как извлечь продукты разделения?
  Центрифужную пробирку прокалывают у основания и в нижнюю ее часть медленно вводят очень плотную среду, например 60—70%-ный раствор сахарозы (весовые %). Находящийся сверху раствор вытесняется, и фракции отбирают при помощи шприца, пипетки или специального приспособления, соединенного через трубочку с коллектором фракций.
  
  Если пробирки изготовлены из целлулоида или нитроцеллю-лозы, фракции извлекают, надрезав пробирку специальным лезвием. Для этого центрифужную пробирку, закрепленную в штативе, надрезают непосредственно под нужной зоной и отсасывают фракцию шприцом или пипеткой.
  
  Сбор фракций осуществляют также, проколов основание пробирки тонкой полой иглой. Капли, вытекающие из пробирки через иглу, собирают в коллектор фракций для дальнейшего анализа.
  

• 42 слайд

  Мембранные технологии
  Мембранные технологии основаны на разделении смесей жидкостей или газов, а также присутствующих в них частиц на составляющие компоненты с использованием частично проницаемых мембран.
  
  Мембрана позволяет определённым молекулам или ионам проходить через неё благодаря диффузии.
  
  Скорость прохождения зависит от давления, концентрации и температуры молекулы или растворённых веществ с обеих сторон, а также проницаемости мембраны для каждого раствора.
  
  Методы мембранных разделений различаются в зависимости от движущей силы, которая обеспечивает прохождение процесса.
  

• 43 слайд

  Мембранные технологии
  Градиент химических потенциалов => ДИАЛИЗ
  
  Электрическое поле => ЭЛЕКТРОДИАЛИЗ
  
  Градиент давлений => УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИЯ
  
  Градиент давлений => ОБРАТНЫЙ ОСМОС
  

• 44 слайд

  Диализ
  Диализ применяют для очистки растворов высокомолекулярных веществ от низкомолекулярных (например обессоливание) или для замены одних низкомолекулярных веществ на другие (перебуферивание).
  

• 45 слайд

  Электродиализ
  Электродиализ применяют для обессоливания. Например, для опреснения морской воды.
  

• 46 слайд

  Ультрафильтрация
  Ультрафильтрация применяется для концентрирования растворов ВМ веществ.