Методическая разработка практического занятия по МДК.04.01 №30

Государственное автономное образовательное учреждение

среднего профессионального образования Республики Крым

«Евпаторийский медколледж»

План занятия (практическое) № 30

Тема занятия:     Проведение микробиологической диагностики  стрептококковых инфекций.  

Дисциплина:       ПМ.04. Проведение лабораторных микробиологических и иммунологических исследований

Специальность:   31.02.03. Лабораторная диагностика

Курс:                      2-ой

МДК 04.01. Теория и практика лабораторных микробиологических и иммунологических исследований

Цели занятия:

Образовательные:

·        Изучить методики индикации  и идентификации стрептококков

·        Рассмотреть патогенез стрептококковых инфекций

·        Рассмотреть профилактику и лечение стрептококковых инфекций

Развивающие:

·         Развивать навыки самообразования, творческие способности студентов

·        Продолжить развитие учебно-интеллектуальных умений;

·        выделять главное и существенное

·        устанавливать причинно-следственные связи

Воспитательные:

·        продолжить формирование эволюционных представлений о развитии органического мира, передачи наследственного материала

·        воспитывать уважение к людям, науки, их достижениям

·        продолжить формирования умения работать в коллективе, принимать совместные решения

·        продолжить формирования здорового образа жизни

Междисциплинарные связи:

1.     Физико-химические методы исследования и техника лабораторных работ

2.     Анатомия и физиология человека

Внутридисциплинарные связи:

1.     Общая микробиология

2.     Иммунология

3.     Санитарная микробиология

Место проведения: кабинет 407

Тип занятия: практическое

Количество часов: 4 академических

Обеспечение занятия: мультимедийное оснащение, таблицы, слайды.

Литература:

     Основные источники:

1. Ф.К.Черкес, Л.Б.Богоявленская, Бельская Н.А. «Микробиология»

М: Альянс 2014г.

2. Камышева К.С. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии  – Ростов н/Д: Феникс, 2015. – 281 с.

Дополнительные источники:

1.     Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: в 2 т. /                                                                 под ред. В. В. Зверева, М. Н. Бойченко. – Том 1. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.- 448 с.

2.     Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований: учебник. Сбойчаков В.Б. 2011. – 608 с

3.     Медицинская и санитарная микробиология: учебное пособие для студентов высш. Мед. Учебн. Заведений/ А.А. Воробьев, Ю.С. Кривошеин, В.П. Широбоков – 3-е изд., стер. – М.: Издательский центр «Академия», 2008. – 464 с., л.цв. вкл.

 Интернет- ресурсы:

1.  МедУнивер – медицинский информационный портал для интересующихся… Общая микробиология. Meduniver.com

2.  Сайт http://rospotrebnadzor.ru/

Студент должен уметь:

1.     Производить посев биологического материала для выделения чистой культуры стрептококков

2.     Определять культуральные, биохимические и иммунологические свойства стрептококков

3.     Дифференцировать стрептококки по их свойствам

Студент должен знать:

1.     Морфологию стрептококков

2.     Классификацию стрептококков

3.     Культуральные, биохимические и иммунологические свойства стрептококков

4.     Профилактические и лечебные препараты, применяемые при стрептококковых инфекциях

Студент должен обладать:

Общие компетенции

ОК 1. Понимать сущность и социальную значимость своей будущей профессии, проявлять к ней устойчивый интерес.

ОК 2. Организовывать собственную деятельность, выбирать типовые методы и способы выполнения профессиональных задач, оценивать их эффективность и качество.

ОК 3. Принимать решения в стандартных и нестандартных ситуациях и нести за них ответственность.

ОК 4. Осуществлять поиск и использование информации, необходимой для эффективного выполнения возложенных на него профессиональных задач, а также для своего профессионального и личностного развития.

ОК 5. Использовать информационно-коммуникационные технологии в профессиональной деятельности.

ОК 6. Работать в коллективе и команде, эф­фективно общаться с коллегами, руководством, пациентами.

ОК 7. Брать ответственность за работу членов команды (подчиненных), за результат выполнения заданий.

ОК 8. Самостоятельно определять задачи профессионального и личностного развития, заниматься самообразованием, осознанно планировать и осуществлять повышение своей квалификации.

ОК 9. Ориентироваться в условиях  смены технологий в профессиональной деятельности.

ОК 10. Бережно относиться к историческому наследию и культурным традициям народа, уважать социальные, культурные и религиозные различия.

ОК 11. Быть готовым брать на себя нравственные обязательства по отношению к природе, обществу, человеку.

ОК 12. Оказывать первую медицинскую помощь при неотложных со­стояниях.

ОК 13. Организовывать рабочее место с соблюдением требований охраны труда, производственной санитарии, инфекционной и противопожарной безопасности.

ОК 14. Вести здоровый образ жизни, заниматься физической культурой и спортом для укрепления здоровья, достижения жизненных и профессиональных целей.

Профессиональные компетенции

ПК 4.1. Готовить рабочее место и аппаратуру для проведения ­ лабораторных микробиологических исследований.

ПК 4.2. Проводить лабораторные микробиологические и иммунологические исследования биологических материалов, проб объектов внешней среды и пищевых продуктов; участвовать в контроле качества.

ПК 4.3. Регистрировать результаты проведенных исследований

ПК 4.4. Проводить утилизацию отработанного материала, дезинфекцию и стерилизацию использованной лабораторной посуды, инструментария, средств защиты.

Структура занятия:

1.     Организационный момент                                                               2 мин.

2.     Мотивация (цели) занятия                                                                3 мин.

3.     Оценка знаний студентов (проверка исходного уровня знаний) 30 мин.

4.     Инструктаж самостоятельной работы студентов                          15 мин.

5.     Практическая часть                                                                          100 мин.

6.     Оформление дневников (зарисовка препаратов, алгоритмов)     20 мин.

7.     Подведение итогов занятия, оценка работы студентов                8 мин.

8.     Задание на дом                                                                                  2 мин.

 Ход занятия

1.                 Организационный момент

 (Приветствие, проверка присутствующих, внешнего вида студентов, сообщение темы, учебных целей занятия) 

Инструктаж по охране труда (роспись в журнале по технике безопасности)

Мотивация  (цели)  занятия:

Изучение методов индикации и идентификации стрептококков является неотъемлемой частью освоения профессионального модуля и формирования профессиональных компетенций

             Мотивация: ОК.1-ОК.14; ПК.4.1-4.4; 

 Актуальность:

Изучение темы «Проведение микробиологической диагностики  стрептококковых инфекций» продолжает цикл практических занятий по индикации и идентификации микроорганизмов и ориентированы на конечную цель подготовки специалистов в соответствии с требованиями. Современные достижения микробиологии, вирусологии и иммунологии, их роль и значение в клинической и профилактической медицине обосновывают важность знаний, которыми должны овладеть студенты в процессе освоения данного модуля. Изучение свойств стрептококков и механизмов  патологического патогенеза стрептококковой инфекции позволит организовывать собственную деятельность, выбирать типовые методы и способы выполнения профессиональных задач. Выявление стрептококков как причины заболеваний увеличивает значение профилактических мероприятий, в т.ч. методов иммунопрофилактики (вакцин, специфических иммуноглобулинов и др.).

Таким образом,  изучение методов исследования стрептококковой инфекции, особенностей  взаимодействия с организмом стрептококков, а также вопросы  профилактики и антибактериальной  терапии, являются неотъемлемой частью формирования компетентностного подхода в подготовке медицинского лабораторного техника.

Оценка знаний студентов (проверка исходного уровня знаний):

а) проверка знаний.

1. По какому признаку кокки объединены в одну группу?

2. Какие ферменты и факторы патогенности продуцируют стрептококки?

3. Какие заболевания вызывают стрептококки?

4. Какие виды стрептококков Вы знаете?

б) проверка внеаудиторной самостоятельной работы

таблицы, презентации, рефераты по темам.

в) подведение итогов контроля:

Оценивание, замечания по работе.

2.                 Практическая часть:

а) подготовка студентов к самостоятельной работе (проведение инструктажа по выполнению заданий):

Микробиологическое исследование

Цель исследования: выявление стрептококка и определение его серовара.

Материал для исследования

1. Слизь из зева (ангина, скарлатина).

2. Соскоб с пораженного участка кожи (рожа, стрептодермия).

3. Гной (абсцесс).

4. Моча (нефрит).

5. Кровь (подозрение на сепсис; эндокардит).

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Основные методы исследования

1. Бактериологический.

2. Микроскопический.

Ход исследования

Первый день исследования

Первый день исследования

Второй день исследования

Вынимают чашки из термостата и просматривают. При наличии подозрительных колоний из части их делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении в мазке стрептококков часть оставшейся колонии пересевают в пробирки на агар с сывороткой для выделения чистой культуры и на бульон с кровью в пробирках. К концу дня 5-6-часовую культуру из бульона или агара пересевают на бульон Мартена с 0,25% глюкозы для определения серологической группы в реакции преципитации по Ленсфильд. Пробирки и флаконы помещают в термостат и оставляют до следующего дня.

Третий день исследования

Вынимают посевы из термостата, проверяют чистоту культуры на скошенном агаре, делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии чистой культуры стрептококка производят посев на среды Гисса (лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит), молоко, желатин, 40% желчь и ставят в термостат.

Просматривают бульон Мартена. При наличии специфического роста ставят реакцию преципитации по Ленсфильд для определения серологической группы.

Постановка реакции преципитации по Ленсфильд. Суточную культуру, выросшую на бульоне Мартена, разливают в несколько центрифужных пробирок, центрифугируют в течение 10-15 мин (3000 об/мин).

Надосадочную жидкость сливают в банку с дезинфицирующим раствором, а осадок заливают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида и вновь центрифугируют. К осадку, собранному из всех центрифужных пробирок, прибавляют 0,4 мл 0,2% хлороводородной кислоты. Затем пробирку помещают в водяную баню и кипятят 15 мин, периодически встряхивая. После кипячения полученную взвесь вновь центрифугируют. Антиген при этом экстрагируется в надосадочную жидкость, которую сливают в чистую пробирку и нейтрализуют 0,2% раствором гидроксида натрия до рН 7,0-7,2. В качестве индикатора прибавляют бромтимоловый голубой (0,01 мл 0,04% раствора). При указанной реакции цвет меняется от соломенно-желтого до голубого.

Затем в 5 преципитационных пробирок разливают по 0,5 мл антистрептококковых групповых сывороток, которые готовят иммунизацией кроликов (см. главу 19). В 1-ю пробирку вносят сыворотку А, во 2-ю - сыворотку В, в 3-ю - сыворотку С, в 4-ю - сыворотку D, в 5-ю - изотонический раствор натрия хлорида (контроль). После этого пастеровской пипеткой во все пробирки по стенке осторожно наслаивают полученный экстракт (антиген).

При положительной реакции в пробирке с гомологичной сывороткой на границе экстракта с сывороткой образуется тонкое молочно-белое кольцо (рис. 38).

Рис. 38. Схема выделения и идентификации стрептококка

Четвертый день исследования

Производят учет результатов (табл. 25).

Таблица 25. Ферментативные свойства стрептококка

Примечание. к - расщепление углеводов с образованием кислоты.

В настоящее время определяют дезоксирибонуклеазу, а также антистрептогиалуронидазу, антистрептолизин-О.

Контрольные вопросы

1. Какие основные методы лабораторного исследования для выявления стрептококков Вы знаете?

2. Для чего ставят реакцию преципитации по Ленсфильд?

3. Почему антиген при постановке этой реакции должен быть прозрачным? Опишите технику постановки этой реакции.

Задание

Получите у преподавателя антистрептококковыс сыворотки А, В, С, D и изотонический раствор натрия хлорида. Поставьте реакцию преципитации, результаты покажите преподавателю и зарисуйте.

Питательные среды

Агар с кровью 

Агар с сывороткой 

Среды Гисса 

Мясопептонный желатин (МПЖ).

Бульон Мартена.

Среда Китта - Тароцци 

1. Морфология пневмококков. Культивирование и ферментативные свойства.

2. Какие факторы обусловливают патогенность пневмококков и что защищает пневмококки от фагоцитоза?

3. Что является основными воротами пневмококковой инфекции. Какие заболевания вызывают пневмококки?

Микробиологическое исследование

Цель исследования: выявление пневмококка.

Материал для исследования

1. Мокрота (пневмония).

2. Слизь из зева (ангина).

3. Отделяемое из язвы (ползучая язва роговицы).

4. Выделение из уха (отит).

5. Гной (абсцесс).

6. Плевральный пунктат (плеврит).

7. Кровь (подозрение на сепсис).

Способы сбора материала

Способы сбора материала

¹ (Лучше брать утреннюю мокроту (при специфической пневмонии мокрота имеет ржавый цвет).)

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Микробиологический.

3. Биологический.

Ход исследования

Первый день исследования

Первый день исследования

Биологическая проба. Немного (3-5 мл мокроты) эмульгируют в стерильном бульоне, 0,5 мл этой смеси вводят внутрибрюшинно белой мыши. Через 6-8 ч у мыши отмечаются признаки заболевания. В это время пневмококк уже можно обнаружить в экссудате брюшной полости. Экссудат берут стерильным шприцем. Из него делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения чистой культуры экссудат засевают на агар с сывороткой. Если мышь погибает или заболевает, делают посев крови из сердца на агар с сывороткой крови для выделения чистой культуры. Посевы ставят в термостат.

Ускоренный метод определения типа пневмококка (реакция микроагглютинации). 4 капли экссудата из брюшной полости зараженной мыши наносят на предметное стекло. К первой капле прибавляют агглютинирующую сыворотку I типа, ко второй - сыворотку II типа, к третьей - III типа, к четвертой - изотонический раствор натрия хлорида (контроль).

Сыворотки I и II типа предварительно разводят в соотношении 1:10, а сыворотку III типа - 1:5. Все капли размешивают, высушивают, фиксируют и окрашивают разведенным фуксином. При положительном результате в одной из капель отмечается скучивание микробов (агглютинация).

Второй день исследования

Посевы вынимают из термостата, просматривают и из подозрительных колоний делают мазки. При наличии в мазках грамположительных ланцетовидных диплококков 2-3 колонии выделяют на скошенный агар с сывороткой для получения чистой культуры. Посевы помещают в термостат. Из бульона делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Третий день исследования

Посевы вынимают из термостата. Проверяют чистоту культуры - делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии в выделенной культуре грамположительных ланцетовидных диплококков проводят идентификацию выделенной культуры путем посева:

1) на среды Гисса (лактоза, глюкоза, сахароза, мальтоза) проводят посев обычным способом - уколом в среду;

2) на среду с инулином;

3) на среду с оптохином;

4) ставят пробу с желчью.

Проба на инулин. Исследуемую культуру засевают на питательную среду, содержащую инулин и лакмусовую настойку, и ставят в термостат. Через 18-24 ч посевы вынимают из термостата. При наличии пневмококков среда окрашивается в красный цвет (стрептококки консистенцию и цвет среды не меняют).

Определение чувствительности к оптохину. Выделенную культуру засевают на 10% агар с кровью, содержащий оптохин 1:50000. Пневмококки, в отличие от стрептококков, не растут на средах, содержащих оптохин.

Проба с желчью. В агглютинационные пробирки наливают по 1 мл исследуемой бульонной культуры. В одну из них добавляют каплю кроличьей желчи, вторая пробирка служит контролем. Обе пробирки помещают в термостат. Через 18-24 ч наступает лизис пневмококков, который выражается в просветлении мутного бульона. В контроле взвесь остается мутной.

Пробу с желчью можно поставить на плотной питательной среде. Для этого на колонию пневмококков, выросших в чашках с агаром и сывороткой, наносят крупинку сухой желчи - колония растворяется - исчезает.

Четвертый день исследования

Производят учет результатов (табл. 26).

Таблица 26. Дифференциация пневмококка от зеленящего стрептококка

Примечание. к - расщепление углеводов с образованием кислоты.

В настоящее время широко используются серологические методы исследования (РСК и РИГА) для определения стрептококковых антител. Определение группы и серовара выделенной культуры производят с помощью флюоресцирующих антител.

Определение вирулентности пневмококка. Суточную бульонную культуру пневмококка разводят 1% пептонной водой от 10^-2 до 10^-8, 0,5 мл каждого разведения вводят двум белым мышам. Культуру, вызвавшую гибель мышей в разведении 10^-7, оценивают как вирулентную, в разведении 10^-4-10^-6 считают средневирулентной. Культура, не вызвавшая гибель мышей, авирулентна.

Контрольные вопросы

1. Какие методы выделения чистой культуры пневмококков Вы знаете?

2. Какое животное наиболее чувствительно к пневмококку?

3. Какие реакции ставят с экссудатом зараженной мыши и с какой целью?

4. От каких представителей гноеродных кокков следует дифференцировать пневмококк и с помощью какой пробы?

5. Как определить вирулентность пневмококков?

Основные характеристики	S/pyogenes	S/agalactiae	S/pneumoniae
Морфология (размеры,  форма, взаиморасположение клеток)
Образование споры
Наличие капсулы
Наличие жгутиков
Окрашивание по Граму
Основные антигены
Основные факторы патогенности

Основные характеристики	S/pyogenes	S/agalactiae	S/pneumoniae
Морфология (размеры,  форма, взаиморасположение клеток)	бактерии шаровидной или овоидной формы, растущие чаще в виде цепочек		чаще диплококки в форме пламени свечи, плоскими концами друг к другу
Образование споры	-	-	-
Наличие капсулы	_	_	+
Наличие жгутиков	-	-	-
Окрашивание по Граму	+	+	+
Наличие каталазы	-	-	-
Основные факторы патогенности	Белок М		Полисахаридная капсула

б) самостоятельная работа студентов:

1.     Приготовить кровяной агар

2.     провести посев гнойного отделяемого или мазков из носоглотки  на кровяной агар

3.     зарисовать схему выделения чистой культуры стрептококков

4.     заполнить таблицу

5.     Сделать выводы  

в) подведение итогов самостоятельной работы

Оформление в рабочей тетради выводов о проделанной работе

 Итоговый контроль 

Решение ситуационных задач (см.приложение №1)

Проверка преподавателем работ студентов

3.                 Задание на дом

Подготовка по теме «Проведение микробиологической диагностики менингококковых и гонококковых  инфекций»

Подведение итогов занятия, оценка работы студентов

Преподаватель оценивает работу студентов, корректирует ошибки, отвечает  на вопросы студентов

Преподаватель  Гончарова А.И.

Приложение №1

Задача №29. В одной группе детсада зарегистрирована вспышка скарлатины.

1) Как лабораторным путем доказать, что у детей скарлатина?

2) Какие методы проводятся для профилактики скарлатины?

Ответ к задаче №29:

1) Необходимо провести бактериологическое исследование: сделать посев слизи из зева на чашки с кровяным агаром, где обратить внимание на рост бета-гемолитических стрептококков, из колоний сделать мазки и, при обнаружении грамположительных цепочек кокков, поставить каталазный тест, который у стрептококков должен быть отрицательным, далее пересеять колонии на сывороточный бульон, где стрептококки дают придонный рост, затем определить серогруппу путем постановки реакции преципитации в геле, следующий этап – определяют серотип путем постановки латекс-агглютинации с М-антисыворотками.

2) Общие меры профилактики сводятся к раннему выявлению больных, соблюдению сроков изоляции (до 10 дней), мер наблюдения за контактными.

Задача №30. Больной обратился к врачу с жалобами на боли в горле, которые беспокоят его периодически на протяжении нескольких последних лет. Врач обнаружил в зеве признаки хронического воспаления.

1) Какие бактерии могли явиться причиной этого заболевания?

2) Как их можно выделить и идентифицировать?

3) Какие лечебные препараты нужно назначить больному?

Ответ к задаче №30:

1) Streptococcus pyogenes.

2) См. ответ задачи №29 п.1.

3) Антибиотики с учетом антибиотикограммы.

Задача №31.Больной с первичной атакой ревматизма госпитализирован для обследования с целью выявления первичного очага стрептококковой инфекции организма.

1) Какой материал нужно подвергнуть исследованию и каким методом?

2) Каким путем можно оценить степень специфического проти­вострептококкового иммунитета?

Ответ к задаче №31:

1) Необходимо исследовать слизь из зева для выявления S. pyogenes (основного возбудителя бактериальной ангины и этиологического фактора ревматизма). Требуется провести его идентификацию бактериологическим методом.

2) Необходимо выявить в сыворотке больного АТ к факторам агрессии и инвазии S. pyogenes: анти-стрептолизин-О, антистрептокиназу, антистрептогиалуронидазу. Титр АТ должен превышать 1/512.

Задача №32. При бактериологическом исследовании мазков из мокроты больного с клиническим диагнозом пневмонии обнаружены грамположительные кокки.

1) Можно ли утверждать, что это возбудитель или необходимо провести дополнительные исследования?

2) Какой метод нужно применить для окончательного решения вопроса о пневмококковой этиологии пневмонии, по каким признакам необходимо идентифицировать культуру?

3) Какие препараты назначить для лечения, если возбудитель пневмококк?

Ответ к задаче №32:

1) Необходимы дополнительные исследования для идентификации выявленных грамположительных кокков.

2) Из грамположительных кокков в качестве возбудителя пневмонии наиболее вероятен S. pneumoniae (пневмококк) или золотистый стафилококк. Необходимо провести посев мокроты на кровяной агар для выделения стрептококков или желточно-солевой агар (ЖСА) для выделения стафилококка. На ЖСА растет только стафилококк.

В случае роста на кровяном агаре необходимо оценить характер гемолиза (пневмококк дает альфа-гемолиз) и продолжить выделение чистой культуры на сахарном бульоне. В дальнейшем для дифференциации с другими стрептококками необходимо провести оптохиновый тест, оценить рост в присутствии желчи (пневмококк не растет), поставить реакцию набухания капсул по Нейсфельду.

3) В случае доказанной пневмококковой этиологии пневмонии препаратом выбора является бензилпенициллин.

Краткое описание документа:

Методическая разработка практического занятия по МДК.04.01 Теория и практика лабораторных микробиологических и иммунологических исследований предназначена для проведения практического занятия по разделу "Частная микробиология" на 2-ом курсе отделения Лабораторная диагностика и включает цели, требования к знаниям и умениям студентов, а также подробное описание техники микробиологического исследования.