Паразитические простейшие.Методы обнаружения простейших.

2.1.Паразитические простейшие.

Методы обнаружения и исследования простейших.

Простейшие – одноклеточные эукариоты, некоторые виды образуют  колонии.  Размеры  простейших  колеблются  от  2  до  50  мк и  больше.  Формы  их  тела  разнообразны. 

Клеточная оболочка у одних видов представлена наружной (цитоплазматической) мембраной, у других – мембраной и пелликулой. Некоторые  группы  простейших  формируют  вокруг  себя  раковинку.

Мембрана  имеет  типичное  для  эукариотической  клетки  строение.Количество ядер – одно, два или более. Форма ядра – обычно округлая.

В цитоплазме находятся органоиды, характерные как для клеток многоклеточных животных, так и свойственные только этой группе животных:  стигмы  (световосприятие),  трихоцисты  (защита),  аксостиль  (опора), сократительные  вакуоли  (осморегуляция)  и  др.  Органоиды  фотосинтеза,  имеющиеся  у  растительных  жгутиконосцев, называются хроматофорами. Органоиды движения простейших представлены псевдоподиями, ресничками, жгутиками.

Питание  –  гетеротрофное;  у  растительных  жгутиконосцев  – автотрофное, может быть миксотрофным.

Газообмен происходит через клеточную оболочку, подавляющее большинство простейших – аэробные организмы.

Ответная  реакция  на  воздействия  внешней  среды  (раздражимость) проявляется в виде таксисов.

При  наступлении  неблагоприятных  условий  большинство простейших образуют цисты (инцистирование). 

Основной способ размножения простейших – бесполое размножение: бинарное деление, множественное деление (шизогония), почкование. В основе бесполого размножения лежит митоз. У ряда видов имеет место половой процесс – конъюгация (инфузории) и половое размножение (споровики).

Среды обитания: морские и пресные водоемы, почва, организмы растений, животных и человека.

МЕТОДЫ ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКОГО

АНАЛИЗА

Нативные (влажные) препараты крови (без окрашивания). Эту очень  простую  методику  (каплю  крови  помещают  под  покровное стекло)  можно  использовать  для  выявления:  трипаносом,  личинок микрофилярий.

Окрашенные мазки крови. При подозрении на наличие паразитов,  из  крови  всегда  следует  одновременно  готовить  тонкий  и  толстый (или толстую каплю) мазки крови. Способы обнаружения паразитов, а в крови и определение их видовой принадлежности основано на  дифференцированном  окрашивании  мембран  органоидов  и  метаболитов  паразита.  Учитывая  морфологию  и  метаболизм  паразитов, применяются  кислые  и  щелочные  растворы  ядерных  красителей. Универсальным  среди  них  является  краситель  Романовского  или азур-2-эозин. При этом ядра паразитических простейших окрашиваются в красный цвет, а цитоплазма в голубой или синий цвет.  В  мазках  крови  могут  быть  выявлены  следующие  паразиты: возбудители  малярии,  трипаносомы;  возбудитель  висцерального лейшманиоза, личинки филярий. Толстая капля крови.

Использование толстых капель крови позволяет сконцентрировать паразитов в исследуемом материале. Толстую  каплю  в  отличие  от  мазка  крови  не  фиксируют.  Под влиянием  водного  раствора  краски  нефиксированные  эритроциты гемолизируются,  препарат  становится  прозрачным.  Это  ускоряет  и облегчает нахождение паразитов, так как в одном поле зрения можно

исследовать гораздо больший объем крови, чем в мазке. Если же толстая капля будет зафиксирована, то гемолиза эритроцитов не произойдет,  они  будут  наслаиваться  друг  на  друга  и  препарат  окажется   непригодным для микроскопии.

Слой  крови  в  толстой  капле  не  должен  быть  очень  толстым, иначе после высушивания она трескается и может отпасть. Нормальной считается  толстая  капля,  через  которую  после  высушивания  слабо просвечивает крупный печатный текст, а при микроскопии в одном поле зрения насчитывается в среднем 10–15 ядер лейкоцитов. Хорошие препараты  крови  можно  приготовить,  только  используя  обезжиренные предметные стекла.

Окраска толстой капли крови. Чем выше температура в помещении, тем быстрее окрашивается препарат, и наоборот. В среднем мазок окрашивается в течение 45–50 мин, толстая капля – 15–30 мин. Если толстые капли сохранялись более недели неокрашенными, что само по себе действует как слабая фиксация, особенно в условиях жаркого климата, то препараты после окраски могут получиться недостаточно прозрачными из-за неполного гемолиза эритроцитов. В таких случаях предварительно  следует  налить  на  препарат  несколько  капель дистиллированной  воды.  Через  10–15  мин  гемоглобин  эритроцитов переходит  в  воду,  придавая  ей  буроватый  оттенок,  а  толстая  капля становится белесоватой. Воду сливают, каплю осторожно прополаскивают дистиллированной водой и затем наливают краску. Правильно  окрашенная  толстая  капля  имеет  фиолетовый  цвет, перекрашенная – темно-фиолетовый цвет, а недокрашенная – светло-голубой цвет. Длительно хранившаяся при высокой температуре или зафиксированная толстая капля приобретает почти черный цвет. С  целью  обнаружения  мелких  паразитов  в  крови  микроскопируют  с  иммерсионным  маслом  под  большим  увеличением  мазок   и толстую каплю крови.

Серологические  исследования  — методы  изучения  определенных  антител  или  антигенов  в  сыворотке  крови  больных,  а  также  выявления антигенов паразитов с целью их идентификации, основан-ные на реакциях иммунитета (таблица 12).

Обнаружение в сыворотке крови больного антител к возбудителю инфекционной болезни или соответствующего антигена позволяет установить  этиологический  фактор  заболевания.  При  выделении паразитарного  заболевания  у  больного  проводится  идентификация возбудителя  путем  изучения  его  антигенных  свойств  с  помощью иммунной диагностической сыворотки (серологическая идентификация микроорганизмов).

Для  выявления  иммунных  комплексов,  образовавшихся  при взаимодействии  антиген-антитело,  используют  различные  методы (серологические  реакции).  Различают  реакции  агглютинации,  преципитации, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов. Реакция  непрямой  (пассивной)  гемагглютинации  (РНГА)  – выявляют антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с  адсорбированными  на  них  антигенами,  в  присутствии  которых происходит  склеивание  и  выпадение  эритроцитов  на  дно  пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде «пуговки».

Реакция с использованием меченых антител или антигенов – реакция  иммунофлюоресценции  (РИФ).  Реакция  основана  на  том, что  антигены  тканей  или  микробы,  обработанные  иммунными сыворотками,  меченными  флюорохромами,  способны  светиться в ультрафиолетовых лучах  люминесцентного микроскопа. В иммуноферментном  анализе  вместо  флюорохромов  иммунную  сыворотку можно метить ферментом (пероксидазой или щелочной фосфатазой). Реакцию оценивают по окрашиванию раствора в желто-коричневый (пероксидаза) или желто-зеленый (фосфатаза) цвет.

Иммуноферментный анализ  (ИФА)  –  лабораторный  иммунологический метод качественного определения и количественного измерения  антигенов  и  антител.  Иммуноферментный  анализ  применяют для  двух  целей:  для  определения  наличия  антигенов  возбудителей различных инфекций, но чаще иммуноферментный анализ применяется для определения наличия антител классов IgA, IgM, IgG к антигенам различных  возбудителей  болезней.  Различают  несколько  десятков модификаций  иммуноферментного  анализа.  Наибольшее  распространение  получил  твердофазный  гетерогенный  иммунный  анализ  – ELISA (англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA).

Радиоиммунологический метод – количественное определение антител или антигенов, меченных радионуклидами.

Полимеразная  цепная  реакция  (ПЦР)  –  метод  молекулярной биологии,  позволяющий  получить  значительное  увеличение  числа копий  определенных  фрагментов  ДНК  в  биологическом  материале (пробе). Полимеразная цепная реакция широко используется в биологической и медицинской практике для диагностики наследственных и инфекционных заболеваний,установления видовой принадлежности паразита, для идентификации мутаций и клонирования генов.

Гельминтологические  методы  исследования  направлены  на выявление яиц, личинок или фрагментов тел гельминтов. Поскольку основная масса гельминтов человека паразитирует в кишечнике, чаще всего  исследуют  фекалии  больного.  Фекалии  должны  доставляться в  лабораторию  свежими,  в  чистой  посуде.  При  необходимости  их консервируют добавлением жидкости, содержащей 1900 мл 0,2%-го водного  раствора  азотнокислого  натрия,  250  мл  крепкого  раствора Люголя,  300  мл  формалина  и  75  мл  глицерина.  Для  обнаружения фрагментов  тел  гельминтов  фекалии  просматривают,  затем  смешивают  с  водой  и  исследуют  небольшими  порциями  в  чашке  Петри   на темном фоне. Все частицы помещают на предметное стекло в каплю

воды  и  исследуют  под  лупой.  Можно  суточную  порцию  фекалий   поместить в цилиндр с добавлением 5–10-кратного количества воды. После  размешивания  сосуд  оставляют  до  полного  осаждения  взвешенных частиц. Поверхностный слой жидкости сливают и наливают чистую воду. Отмытый осадок просматривают небольшими порциями в чашках Петри под лупой. Для обнаружения яиц применяют микроскопические методы исследования.

Метод  нативного  мазка.  Небольшое  количество  фекалий    из разных мест исследуемой порции растирают на предметном стекле в капле 50%-го раствора глицерина, изотонического раствора хлорида натрия или воды. Смесь накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом.

Метод всплывания  по Фюллеборну.  Одну  часть  фекалий  размешивают в 20 частях насыщенного раствора хлорида натрия (удельный  вес  1,18),  добавляемого  небольшими  порциями.  Всплывшие                 

на  поверхность  крупные  частицы  немедленно  удаляют,  а  смесь оставляют  на  45  минут.  В  течение  этого  времени  яйца  гельминтов, имеющие  меньший  удельный  вес,  чем  раствор  хлорида  натрия, всплывают на поверхность. Поверхностную пленку снимают проволочной  петлей  диаметром  около  1  см  и  переносят  на  предметное стекло для исследования под микроскопом.

Метод Калантарян. Эффективность метода всплывания повышается  при  замене  хлорида  натрия  насыщенным  раствором  азотнокислого натрия. В этом случае смесь выдерживают 10–15 минут. Поверхностную  пленку,  образующуюся  после  отстаивания  смеси фекалий с раствором хлорида натрия или азотнокислого натрия, можно снимать и предметным стеклом. С этой целью баночку, налитую до краев смесью фекалий с раствором соли, накрывают предметным стеклом так, чтобы  нижняя  его  поверхность  соприкасалась  с  жидкостью.  После отстаивания стекло снимают и, быстро повернув кверху поверхностью, на которой находится пленка, просматривают под микроскопом.

Соскоб  с  перианальных  складок  (для  выявления  яиц  остриц) делают утром до совершения туалета. Деревянным шпателем, смоченным  в  воде  или  в  50%-м  растворе  глицерина,  производят соскабливание вокруг  анального отверстия.  Полученный  материал переносят на предметное стекло в каплю воды или 50%-го раствора глицерина  и  просматривают  под  микроскопом.  Шпатель  можно   заменить влажным ватным тампоном, которым протирают перианальную область, затем хорошо прополаскивают в воде. Воду центрифугируют и осадок исследуют под микроскопом.

Метод  Берманна  (для  выявления  личинок).  Металлическую сетку с нанесенными на нее 5–6 г фекалий укрепляют на стеклянной воронке, вставленной в штатив. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом. Воронку наполняют водой, подогретой до 50 °С, так, чтобы нижняя часть сетки с фекалиями соприкасалась   с водой. Личинки активно переходят в воду и скапливаются в нижней части резиновой трубки. Через 4 часа жидкость помещают в центрифужные  пробирки,  центрифугируют  и  осадок  просматривают  под микроскопом.

Анализ  мокроты,  носовой  слизи  и  влагалищных  выделений используют  для  выявления  яиц  легочного  сосальщика,  личинок аскарид  и  анкилостомид,  яиц  остриц,  фрагментов  эхинококкового пузыря.  Исследуемую  порцию  слизи  (выделений)  намазывают  на стекло и просматривают на черном и белом фоне под лупой, а затем под  микроскопом.  Можно  добавить  к  исследуемому  материалу 25%-й  раствор  антиформина,  тщательно  взболтать  и  выдержать               

1–1,5 часа в термостате для растворения слизи. Смесь центрифугируют и осадок исследуют под микроскопом. Анализ дуоденального и желудочного сока проводят для выявления яиц печеночных трематод, анкилостомид, личинок кишечной угрицы. Все три порции дуоденального содержимого, полученные при зондировании, центрифугируют и осадок исследуют под микроскопом.

Исследование  тканей.  Для  выявления  личинок  трихинелл кусочки биопсированной мышцы тщательно расщепляют на волоконца, сдавливают между компрессорными стеклами (толстые стекла с винтами) и исследуют под микроскопом с затененным светом. 

Для  выявления  цистицерков  мышцы  расслаивают  препаровальными  иглами,  выделенный  пузырек  очищают  от  окружающей ткани, сдавливают между двумя предметными стеклами и исследуют под лупой. 

Магнитно-резонансная томография (МРТ) – это метод иссле-дования  внутренних  органов  и  тканей  человека  без  использования рентгеновских лучей. Магнитно-резонансная томография использует радиоволны  и  магнитные  поля  для  получения  изображения  мягких тканей, органов и костей.

Ультразвуковые исследования (УЗИ) – метод, который применяется  для  исследования  состояния  внутренних  органов,  диагностирования хронических изменений тканей органов и заболеваний различной этиологии.

  

Краткое описание документа:

Данный материал будет полезен на дополнительных факультативах/ элективах/курсах в школе, а также при изучении основ паразитологии в организациях "Среднего профессионального образования" и "Высшего профессионального образования".

Конспект можно рассматривать как лекционный материал,можно дополнить его видеороликами или презентация с наглядными примерами методов исследований простейших.