РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ для проведения практических занятий по разделу ПМ.03 ПРОВЕДЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ по специальности среднего профессионального образования 31.02.03 Лабораторная диагностика для студентов 2 курса

Государственное автономное образовательное учреждение среднего профессионального образования Республики Крым

 «Евпаторийский медицинский колледж»

РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ

для проведения практических занятий по разделу

ПМ.03 ПРОВЕДЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

по специальности среднего профессионального образования

31.02.03 Лабораторная диагностика

для студентов 2 курса

                                             Студента группы __________________

                                              Имя ______________________________

Евпатория

2022

СОГЛАСОВАНО ЦМК лабораторных дисциплин Протокол №_______ от «____»___________2022г. Председатель_________А.И.Гончарова

Рассмотрено и одобрено                     Педагогическим советом                     Протокол № _______                     от «____» _______ 2022г.

Рабочая тетрадь для практических занятий предназначена для практических занятий по МДК. 03.01. Теория и практика лабораторных биохимических исследований. Её цель помочь студентам подготовиться к практическим занятиям, самостоятельной будущей работе с пациентами, повторить и закрепить изучаемый на базовом уровне лекционный материал. Работая над имеющимися в тетради заданиями, студент сможет проверить свои знания и практические умения, что облегчит подготовку к экзамену и дальнейшее изучение последующих профессиональных модулей.

         Рабочая тетрадь составлена на основании Государственных образовательных стандартов к уровню подготовки выпускников по специальности 31.02.03 Лабораторная диагностика.       По каждой теме в соответствии с программой разработаны и указаны задания для самоподготовки и способы их выполнения.

Разработчик: Гарибова Л.С., к.б.н., преподаватель высшей квалификационной категории.

Содержание

Название темы	Кол-во часов	Оценка
Раздел 2. Проведение лабораторных биохимических исследований по определению активности ферментов (семестр III)
Практическое занятие №13 Определение активности ферментов на биохимическом анализаторе	4
Практическое занятие №14 Обнаружения свойств ферментов	4
Практическое занятие №15 Определение специфичности действия ферментов	4
Практическое занятие №16 Определение АлАТ в сыворотке крови	4
Практическое занятие №17 Определение АсАТ в сыворотке крови	4
Практическое занятие №18 Определение каталитической активности γ - глутамилтрансферазы в сыворотке крови	4
Практическое занятие №19 Определение активности креатинфосфокиназы (КФК) в сыворотке крови.	4
Практическое занятие №20 Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови	4
Практическое занятие №21 Определение общей активности ЛДГ по оптимизированному оптическому тесту	4
Практическое занятие №22 Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови	4
Практическое занятие №23  Определение активности кислой фосфатазы в сыворотке крови	4
Практическое занятие №24 Определение активности холинэстеразы	4
Практическое занятие №25 Определение активности α – амилазы в сыворотке крови. Контрольный срез.	4
Практическое занятие №26 Проведение дифференциальной диагностики заболеваний печени по показателям активности ферментов. Диф. зачет.	4
Темы рефератов:
ИТОГОВАЯ ОЦЕНКА

Раздел 3. Проведение лабораторных биохимических исследований по  изучению обмена веществ и энергии ферментов Раздел 4. Проведение лабораторных биохимических исследований по  определению показателей углеводного обмена  (семестр IV)
Практическое занятие №27 Количественное определение витамина С с 2,6-дихлорфенолиндфенолом	4
Практическое занятие №28 Проведение качественных реакций на стероидные и тиреоидные гормоны	4
Практическое занятие №29 Обнаружение лактозы и мальтозы	4
Практическое занятие №30 Проведение качественных реакции на глюкозу	4
Практическое занятие №31 Определение концентрации молочной кислоты	4
Практическое занятие №32 Проведение экспресс метода определения глюкозы	4
Практическое занятие №33 Определение концентрации глюкозы в крови	4
Практическое занятие №34 Исследования функции поджелудочной железы методом сахарной нагрузки	4
Практическое занятие №35 Определение концентрации пировиноградной кислоты в сыворотке крови	4
Практическое занятие №36 Определение концентрации сиаловых кислот в сыворотке крови	4
Практическое занятие №37  Определение гаптоглобина в сыворотке крови	4
Практическое занятие №38 Контрольный срез	2
Темы рефератов:
ИТОГОВАЯ ОЦЕНКА

Практическое занятие № 13

Тема занятия: Определение активности ферментов на биохимическом анализаторе

Цели занятия:

·     ознакомление с биологической ролью ферментов;

·     рассмотреть строение ферментов;

·     ознакомление с работой различных видов биохимических анализаторов;

·     изучение методов определения активности ферментов на биохимическом анализаторе.

Ход занятия:

    Вопросы к устному фронтальному опросу:

1.   Что такое фермент?

2.   Какова химическая природа фермента?

3.   Дайте определение понятию «энергия активации».

4.   Дайте определение понятию «энергетический барьер» реакции.

5.   Каковы отличия ферментов от неорганических катализаторов?

6.   Перечислите основные свойства ферментов.

7.       Что представляют собой биохимические анализаторы? виды анализаторов? Какие ферменты определяют?

Практическая часть

Демонстрация практических умений и навыков при работе на биохимическом анализаторе; разбор алгоритмов действия практических навыков, рекомендации по выполнению.

Практическое занятие № 14

Тема занятия: Обнаружения свойств ферментов

Цели занятия:

· изучение свойств ферментов (на примере слюны);

·     ознакомление с  методами определения ферментов;

·     рассмотреть основные методы определения ферментов, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях и сравнить  их;

·     изучение цветных реакции применяемых  для установления свойств ферментов;

·     идентификация ферментов

Ход занятия:

Вопросы к устному фронтальному опросу:

1.            Факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций

2.            Что происходит при повышении концентрации фермента?

3.            В какой зависимости находится концентрация субстрата  и концентрация фермента?

4.            Как изменение температуры влияет на скорость ферментативных реакций

5.            Как изменение рН среды изменяет скорость ферментативных реакций

6.            Привести примеры ферментов – активаторов и ферментов – ингибиторов

7.            Какие виды ингибирования вы знаете?

8.            Какие виды обратимого ингибировании известны?

Практическая часть

Обнаружения свойств ферментов

Оснащение: Пробирки, пипетки, маркер, термостат.

Реактивы: собственная слюна, р-р крахмала и сахарозы, р-р йода, р-р сульфата меди, р-р гидроокиси натрия, р-р хлористоводородной кислоты, р-р хлорида натрия, Н2О.

Опыт №1 «Специфичность действия ферментов»

Ход определения: А. В 1 пробирку вносят 10 капель раствора крахмала, в др. – такое же кол-во сахарозы. В обе пробирки добавляют по 4 капли раствора слюны, помещают в термостат на 15 минут при температуре 37⁰  С. С содержимым пробирок выполняют реакцию с раствором йода.

Ход определения: Б. В 1 пробирку вносят 10 капель раствора крахмала, в др. – такое же кол-во раствора сахаразы, помещают в термостат на 15 минут при температуре 37⁰ С. С содержимым каждой пробирки выполняют реакцию с раствором йода и реакцию Троммера.

1)    10 к. крах.à 4 к. слюны à t – 15⁰ C à У à

2)    10 к. сахар. à 4 к. слюны à t – 15⁰ C à У à

Опыт № 2 «Влияние температуры на активность ферментов»

Ферменты термолабильны и проявляют оптимальную активность при температуре 35⁰ - 45⁰ С. При повышении температуры их активность снижается, а затем происходит разрушение структуры молекулы фермента.

Ход определения: В 2 пробирки вносят по 10 капель раствора крахмала. В 1 из них добавляют 5 капель раствора слюны, в др. – такое же кол-во предварительно прокипяченной слюны. Пробирки встряхивают, помещают в термостат на 15 минут при температуре 37⁰ С. Охлаждают и проделывают реакцию с раствором йода и реакцию Троммера.

1)    10 к. крах. à 4 к. слюны à t – 15⁰ C à У à

2)    10 к. сахар. à 4 к. слюны à t – 15⁰ C à У à

Опыт № 3 «Влияние pН среды на активность ферментов»

Ход определения: В 8 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл дист. воды. В 1 пробирку вносят 1 мл. раствора хлористоводородной кислоты, перемешивают, отбирают из этой пробирки 1 мл смеси и переносят его во 2 пробирку. Содержимое 2 пробирки перемешивают, отбирают 1 мл полученной смеси и переносят в 3 пробирку и т.д. Из 8 пробирки 1 мл. смеси выливают. Таким образом в пробирках получают разведение хлористоводородной кислоты в убывающей концентрации, соответствующей различным значениям рН среды. После этого в каждую пробирку добавляют по 2 мл раствора крахмала и по 1 мл. раствора слюны. Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 15 минут при температуре 37⁰ С. Затем охлаждают под проточной водой и добавляют по 1 капли раствора йода. Отмечают, при каждой концентрации хлористоводородной кислоты произошел полный гидролиз крахмала.

Опыт № 4 «Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов»

Ход определения: В 3 пробирки отмеривают по 10 капель раствора слюны. Затем добавляют по 1 капле: в 1 – хлорида натрия, во 2 – сульфат меди, в 3 – воды. Перемешивают, вносят в каждую пробирку по 5 капель раствора крахмала и оставляют на 3 минуты при комнатной температуре. Затем добавляют по 1 капле раствора йода, перемешивают, наблюдают за окраской и определяют в какой пробирке действовал активатор или ингибитор.

Вывод:

  Практическое занятие № 15

Тема занятия: Определение специфичности действия ферментов

Цели занятия:

·     изучение специфичности действия ферментов (на примере слюны);

·     ознакомление с  методами определения специфичности ферментов;

·     рассмотреть основные методы определения специфичности ферментов, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях и сравнить  их;

·     изучение цветных реакции применяемых  для установления специфичности  ферментов.

Вопросы к устному фронтальному опросу:

1.       Определение понятия «активный центр».

2.       Определение понятия «Определение понятия ферменто- субстратный комплекс».

3.       Определение понятия «изоферменты».

4.       Определение понятия «аллостерический центр».

5.       Определение понятия «каталитический центр».

6.       У какого соединения каталитическая активность выше: у профермента или фермента?

Практическая часть

Ферментативный гидролиз крахмала

Оснащение: Пробирки, пипетки, маркер, термостат.

Реактивы: собственная слюна, р-р крахмала и сахарозы, р-р йода, р-р сульфата меди, р-р гидроокиси натрия, р-р хлористоводородной кислоты, р-р хлорида натрия, Н2О.

Ход определения: В 2 пробирки наливают по 10 капель раствора крахмала. В 1 пробирку вносят 5 капель воды, а во 2 – 5 капель раствора слюны. Перемешивают и ставят в термостат на 15 минут при 37⁰ С.

В 2 чистые пробирки отбирают по 4 капли содержимого 1 пробирки. В одну из них прибавляют 1 каплю раствора йода. Наблюдают и записывают результат. В др. добавляют 1 каплю сульфата меди и 4 капли гидроокиси натрия, нагревают до кипения. Отмечают результат.

Аналогичные реакции проделывают с содержимым 2 пробирки.

Вывод:       _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

Практическое занятие № 16

Тема занятия: «Определение АлАТ в сыворотке крови»

Цели занятия: 

· изучение методики определения АлАТ в сыворотке крови;

·     рассмотреть основные методы определения АлАт, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях и сравнить  их;

·     клинико- диагностическое значение изучения методики определения АлАТ в сыворотке крови.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, полуавтоматические дозаторы, секундомер, термостат, ФЭК, кюветы.

 Реактивы: набор для определения АлАТ, Н2О

Принцип метода: Под действием фермента аланинаминотрансферазы (АЛТ) в результате переаминирования происходит перенос перенос аминогруппы с аланина на α-кетоглутарат. Активность АЛТ пропорциональна количеству образовавшихся динитрофенилгидразонов пирувата в щелочной среде, которое определяется фотометрически.

Алгоритм определения:

Компоненты реакционной среды	Опытная проба	Контрольная проба
Реагент № 1, мл	0,25	0,25
Сыворотка крови, мл	0,05	-
Инкубация при температуре 37°С в течении 30 мин.
Реагент № 2, мл	0,25	0,25
Сыворотка, мл	-	0,05

 Пробы перемешивают и инкубируют 20 мин при комнатной температуре (18-20°С). Затем в пробирки внесите по 2,5 мл разведенного реагента № 3, перемешайте реакционную смесь и через 10 мин измерьте оптические плотности опытных и соответствующих контрольных проб против дистиллированной воды при длине волны 537 нм (500-560 нм).

Расчет активности (А) фермента проведите по формуле: А = (Еопыт – Еконтр) * К , где

Еопыт – оптическая плотность опытной пробы; Еконтр – оптическая плотность контрольной пробы; К – коэффициент, рассчитанный по калибровочному графику.

Нормальные величины: До 0,19 мкмоль или до 0,68 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение определения активности АЛТ:

_____________________________________________________________________

____________________________________________________________________

____________________________________________________________________

____________________________________________________________________

Практическое занятие № 17

Тема занятия: «Определение АсАТ в сыворотке крови»

Цели занятия:

·  изучение методики определения АсАТ в сыворотке крови;

·     рассмотреть основные методы определения АсАТ, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях и сравнить  их;

·     клинико- диагностическое значение изучения методики определения АсАТ в сыворотке крови.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, полуавтоматические дозаторы, секундомер, термостат, ФЭК, кюветы.

Реактивы: набор для определения АсАТ, Н2О

Принцип метода: Аспартат-аминотрансфераза катализирует реакцию между L-аспартатом и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и оксалацетат. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислоты в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты, возникающей при самопроизвольном декарбоксилировании оксалацетата, обладает более высокой оптической плотностью.

Алгоритм определения

Компоненты реакционной среды	Опытная проба	Контрольная проба
Реагент № 1, мл	0,25	0,25
Сыворотка крови, мл	0,05	-
Инкубация при температуре 37°С в течении 60 мин.
Реагент № 2, мл	0,25	0,25
Сыворотка, мл	-	0,05

Клинико-диагностическое значение определения АсАТ: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________     

Практическое занятие № 18

Тема занятия: «Определение каталитической активности γ – глутамилтрансферазы в сыворотке крови»

Цели занятия:

·  изучение методики определения каталитической активности γ – глутамилтрансферазы в сыворотке крови;

·     рассмотреть основные методы определения каталитической активности γ – глутамилтрансферазы, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях и сравнить  их;

·     клинико - диагностическое значение изучения методики определения каталитической активности γ – глутамилтрансферазы в сыворотке крови.

                                  Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, полуавтоматические дозаторы, секундомер, термостат, ФЭК, кюветы, бумага для построения графика

 Реактивы: набор для определения γ – глутамилтрансферазы, Н2О

Принцип метода: γ – ГТФ катализируют реакцию переноса L- γ-глутаминогвого остатка с L- γ-глутамил -3-карбокси-4-нитроанилида на глицил-глицин. кол-во освобожденного 4-нитроанилина служит мерой активности γ-ГТФ.

Ход определения: в пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и помещают в водяную баню при температуре 37°С, приливают 0,05 мл исследуемой сыворотки крови. Содержимое перемешивают и инкубируют точно 15 мин. Затем прибавляют 3 мл уксусной кислоты и перемешивают. Контроль ставят также. Длина волны на ФЭКе 400-500 нм.

Алгоритм определения:

Внести в кювету	Макроанализ	Микроанализ
Рабочий реагент, мкл	1000	300
Сыворотка крови, мкл	100	30
Смешать и инкубировать при 37°С в течение 1 минуты. Измерить ΔЕ/мин в течение 3-х минут. Вычислить среднее значение ΔЕ/мин. Если значение ΔЕ/мин превышает величину 0,200 А/мин, развести исследуемый образец физиологическим раствором, повторить анализ, а результат умножить на степень разведения.

Клинико-диагностическое значение определения γ – ГТФ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________     

Практическое занятие № 19

Тема занятия: «Определение активности креатинфосфокиназы (КФК) в сыворотке крови»

Цели занятия:

·  изучение методики определения активности  КФК  в сыворотке крови;

·     рассмотреть основные методы определения активности  КФК, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях и сравнить  их;

·     клинико- диагностическое значение изучения методики определения активности  КФК  в сыворотке крови.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, полуавтоматические дозаторы, секундомер, термостат, ФЭК, кюветы.

Посуда для определения креатинкиназы не должна содержать следы фосфатов.

 Реактивы: набор для определения креатинфосфаткиназы, Н2О

Принцип метода. Креатинкиназа катализирует превращение креатинина в креатинфосфат. Ион фосфата, освобожденный при гидролизе креатинфосфата, определяют после депротеинирования как желтый комплекс фосфорно-ванадиево-молибденовой кислоты.

Ход определения: Предварительно все растворы реактивов прогревают в течение 5 мин при температуре 37 °С. Опытная проба: в пробирку вносят 1,5 мл основной смеси реактивов, 0,1 мл раствора цистеина и 0,4 мл сыворотки крови. Содержимое пробирки осторожно перемешивают и ставят в термостат при температуре 37 °С на 30 мин. Затем прибавляют 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 мин. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после прибавления раствора трихлоруксусной кислоты. Из опытной и холостой проб забирают по 1 мл надосадочной жидкости и переносят в химические пробирки (маркированные соответствующим образом), в которых содержится по 2 мл смеси растворов для проведения специфического гидролиза креатинфосфата. Полученную смесь растворов перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин (время гидролиза креатинфосфата). После этого в пробы добавляют с интервалом в 1 минуту по 0,25 мл раствора эйконогена и точно через 15 мин опытную пробу измеряют против холостой пробы при длине волны 600—700 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см. Расчет производят по калибровочному графику.

NH                                                                                     NH    H                OH

C   NH2           АТФ                                       АДФ           C       N       P       O

N   CH3                                                                              N       CH3           OH

CH2                  креатинфосфокиназа в сыворотке крови      CH2

COOH                                                                                COOH

Креатин                                                                             креатинфосфат

Клинико-диагностическое значение определения КФК:

_________________________________________________________________

________________________________________________________________ ______________________________________________________________

_________________________________________________________________

_________________________________________________________________

_________________________________________________________________

Практическое занятие № 20

Тема занятия: «Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови»

Цели занятия:

·  изучение методики определения активности ЛДГ в сыворотке крови;

·     рассмотреть основные методы определения активности ЛДГ, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях и сравнить  их;

·     клинико- диагностическое значение изучения методики определения ЛДГ в сыворотке крови.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, полуавтоматические дозаторы, секундомер, термостат, ФЭК, кюветы.

Реактивы: набор для определения ЛДГ, Н2О

Исследуемый материал: сыворотка, плазма (антикоагулянт гепарин) крови должна быть отделена от сгустка как можно раньше. Сыворотка должна быть без признаков гемолиза, т.к. активность фермента в эритроцитах выше чем в сыворотке. ЛДГ в сыворотке и плазме стабильна 2 дня при комнатной температуре или 24 часа при t 2-8 °C.

Цель теста: Этот тест чаще всего используется для мониторинга течения инфаркта миокарда.
ЛДГ — фермент, который присутствует во всех органах и тканях. В эритроцитах его уровень в 100 раз выше чем в сыворотке. Поэтому даже незначительный гемолиз сыворотки может привести к ложнозавышенному результату! ЛДГ имеет пять изоферментов. Определяя уровень ЛДГ мы определяем уровень пяти различных изоферментов. Каждый из пяти изоферментов ЛДГ сконцентрирован в определенных тканях. Измерения отдельных уровней изофермента ЛДГ могут помочь в диагностике места поражения:

·                        ЛДГ-1, сердце, эритроциты, почки.

·                        ЛДГ-2, сердце, эритроциты, почки.

·                        ЛДГ-3, легкие и другие ткани.

·                        ЛДГ-4, лейкоциты, лимфоузлы, скелетная мускулатура, печень.

·                        ЛДГ-5, печень, скелетная мускулатура.

 Референтные значения: 207-414 Ед/л (единиц в литре).

Клинико-диагностическое значение определения ЛДГ:  ____________________________________________________________________________________________________________________________________ 

Практическое занятие № 21

Тема занятия: «Определение общей активности ЛДГ по оптимизированному оптическому тесту»

Цели занятия:

·  изучение методики определения активности ЛДГ по оптимизированному оптическому тесту;

·     рассмотреть основные методы определения активности ЛДГ, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях и сравнить  их;

·     клинико - диагностическое значение изучения методики определения ЛДГ в сыворотке крови.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, полуавтоматические дозаторы, секундомер, термостат, ФЭК, кюветы.

Реактивы: набор для определения ЛДГ, Н2О

Принцип метода: В методе использовано различие в спектрах поглощения окислительной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотида (НАД) при длине волны 340 нм.

Ход определения:

      Устанавливают на спектрофотометре длину волны 340нм. В спектрофотометрической кювете с длиной оптического пути 10мм смешивают 1,5 мл пирофосфатного буфера,1,0 мл раствора лактата лития ,0,3 мл ра-ра НАД. Добавляют 0,2 мл исследуемой сыворотки крови, перемешивают стеклянной палочкой содержимое кюветы, рукояткой «щель» устанавливают стрелку микроамперметра на «0» и засекают время. Ровно через 3 мин. отмечают величину оптической плотности. До начала исследования необходимо прогреть все реактивы и сыворотку при температуре 30° С.

      Расчет.        Активность фермента рассчитывают по формуле:

,

где А – активность фермента в исследуемой сыворотки крови, нмоль/(с л);
 коэффициент молярной экстинкции НАД  Н, при длине волны 340 нм он равен 6,22
1- длина оптического пути (рабочая ширина кюветы), м (1 );
конечный объем пробы, 3 мл;
объем сыворотки крови в инкубационной смеси, 0,2 мл;
 – изменение экстинкции за 1 с инкубации.

Нормальные значения результатов: до 533 нмоль/(с л) при 30.

Клинико-диагностическое значение определения ЛДГ: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________     

Практическое занятие № 22

Тема занятия: «Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови»

Цели занятия:

·  изучение методики определения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови;

·     рассмотреть основные методы определения активности щелочной фосфатазы, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях и сравнить их;

·     клинико- диагностическое значение изучения методики определения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, полуавтоматические дозаторы, секундомер, термостат, ФЭК, кюветы.

Реактивы: набор для определения ЩФ, Н2О

Принцип метода: под действием фермента присутствующего в сыворотке крови - щелочной фосфатазы (К.Ф.3.1.3.1.) происходит гидролиз b-глицерофосфата с освобождением неорганического фосфора. Активность фермента пропорциональна количеству выделившегося неорганического фосфора.

Ход определения: В центрифужные пробирки вносят b-глицерофосфатный буфер, прогревают в уль-тратермостате до 37°С (10 минут) и запускают ферментативную реакцию, добавляя в пробирку с опытной пробой 0,1 мл сыворотки крови. Инкубируют точно 60 минут при 37 °С. По истечении указанного времени в опытные пробирки добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Перемешивают, охлаждают под струёй водопроводной воды и центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. В пробу № 2 по окончании инкубации субстрата добавляют сыворотку и сразу же ТХУ.В контрольную и стандартную пробы вносят реактивы по завершении инкубации согласно прописи. Затем определяют концентрацию неорганического фосфора в пробах.

Клинико-диагностическое значение определения ЩФ: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Практическое занятие № 23

Тема занятия: «Определение активности кислой фосфатазы в сыворотке крови»

Цели занятия:

·  изучение методики определения активности кислой фосфатазы в сыворотке крови;

·     рассмотреть основные методы определения активности кислой фосфатазы, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях и сравнить их;

·     клинико- диагностическое значение изучения методики определения активности кислой фосфатазы в сыворотке крови.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, полуавтоматические дозаторы, секундомер, термостат, ФЭК, кюветы.

Реактивы: набор для определения ЩФ, Н2О

Подготовка к диагностике: После пальпации простаты или ее инструментального исследования, включая биопсию, а также после катетеризации мочевого пузыря, до взятия крови на исследование кислой фосфатазы должно пройти не менее 48 часов, так как после этих процедур могут наблюдаться ложноположительные результаты.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, полуавтоматические дозаторы, секундомер, термостат, ФЭК, кюветы.

Реактивы: набор для определения ЩФ, Н2О

Ход определения: В одну пробирку вносят 0,5 мл буферного р-ра, содержащего цитрат натрия, п- нитрофенилфосфат и хлорида натрия, в другую пробирку - 0,5 мл р-ра содержащего тартрат калия, п- нитрофенилфосфат и хлорида натрия, и нагревают до 37 С в течении 5 мин. Добавляют в обе пробирки по 0,1 мл исследуемой сыворотки или плазмы крови и инкубируют в течении 30 мин. температура 37С. Затем в обе пробирки добавляют по 2,0 мл. 0,1 Н р-ра гидроксида натрия. В контрольную пробу вносят 0,5 мл р-ра А, далее обрабатывать так же, как опытную пробу, но сыворотку или плазму добавляют после инкубации. Фотометрируют при длине волны 405 нм в кювете толщиной 1 см против дистиллированной воды.

Рассчитываем по калибровочному графику. Норма 67-167 нмоль/ (схл); тартрат –лабильной фракции КФ  0-16,7 нмоль/ (схл).

Клинико-диагностическое значение определения КФ: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________     

Практическое занятие № 24

Тема занятия: «Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови»

Цели занятия:

·  изучение методики определения активности холинэстеразы в сыворотке крови;

·     рассмотреть основные методы определения активности холинэстеразы, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях и сравнить  их;

·     клинико- диагностическое значение изучения методики определения активности холинэстеразы в сыворотке крови.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, полуавтоматические дозаторы, секундомер, термостат, ФЭК, кюветы.

Реактивы: набор для определения ХЭ, Н2О

Принцип метода: Под действием холинэстеразы происходит гидролиз ацетилхолина и подкисление среды выделяющейся уксусной кислотой. Сдвиг pH устанавливается с помощью индикатора фенолового красного.

Способ может быть использован в медицине, а именно при измерении активности холинэстеразы крови. Фотометрическим методом при длине волны 580 нм измеряют скорость ферментативного гидролиза бутирилтиохолина в буфере с использованием в качестве индикатора на тиольную группу 4,4'-бис-(2-гидрокси-6,8-дисульфо-1-нафтилазо)-фенилдисульфида тетракалиевой соли. Скорость ферментативного гидролиза субстрата оценивают по тангенсу угла наклона начального участка кинематической кривой зависимости оптической плотности от времени ферментативного гидролиза бутирилтиохолина. Способ повышает точность измерения скорости ферментативного гидролиза, упрощает анализ и сокращает время его проведения.

Изобретение относится к медицинской биохимии, методам исследования ферментативных процессов и может быть использовано в исследовательских и клинико-биохимических лабораториях для контроля и диагностики персонала, пораженного веществами антихолинэстеразного действия, например фосфорорганическими отравляющими веществами или некоторыми пестицидами, путем определения активности холинэстеразы в крови.

При отсутствии соединений антихолинэстеразного действия предлагаемый способ определения активности холинэстеразы может быть использован в клинико-биохимических лабораториях для диагностики и определения степени тяжести больного гепатитом, циррозом, а также саркомой с метастазами в печени.

Ход определения:

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до 37°С. Температура должна быть стабильной (+/- 0,5°С) в течение всего определения.

Добавить в термостатированную кювету (мкл)	Бланк по реагенту	Опытная проба
Дистиллированная вода	20	-
Проба	-	20
Реагент 1	1000	1000
Перемешать, инкубировать 5 минут при 37°С.
Реагент 2	200	200

Тщательно перемешать, инкубировать 90 секунд. Измерить оптическую плотность бланка по реагенту и опытной пробы; повторить измерения точно через 30, 60, 90 секунд. Рассчитать среднее ДА / 30 сек.

 Расчет активности холинэстеразы в пробе производится следующим образом:

Активность холинэстеразы Е/л (37°С) = (АА/30 среднее пробы - АА/30 среднее бланка) х 131,6х103

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ

Взрослые (37°С)

Мужчины         5100 - 11700 Е/л

Женщины        4000 - 12600 Е/л

Клинико-диагностическое значение определения ХЭ:

_____________________________________________________________ _____________________________________________________________

__________________________________________________________

_____________________________________________________________

Практическое занятие № 25

Тема занятия: «Определение α –амилазы в сыворотке крови.

Контрольный срез»

Цели занятия:

·  изучение методики определения α –амилазы в сыворотке крови методом Каравея;

·     рассмотреть основные методы определения α –амилазы в сыворотке крови, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях и сравнить их;

·     клинико- диагностическое значение изучения методики определения α –амилазы в сыворотке крови методом Каравея.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, полуавтоматические дозаторы, секундомер, термостат, ФЭК, кюветы.

Реактивы: набор для определения α –амилазы, Н2О

Принцип метода: Под действием альфа-амилазы крахмал гидролизируется с образованием продуктов не дающих цветной реакции с йодом. Интенсивность уменьшения  окраски йод-крахмального комплекса в единицу времени пропорциональна активности  фермента и измеряется  фотометрически при длине волны 670(630-690)нм

Алгоритм определения

Поместить в пробирки	Опытная проба	Контрольная проба
Рабочий раствор 1, мл (буфер фосфатный и субстрат 24:1 )	0,5	0,5
Инкубировать в водяной бане при 37С, 5 минут.
Образец, мл	0,01	---
Смешать и инкубировать в водяной бане при 37С, 5 минут.
Рабочий раствор 3,мл (дистиллированную воду и Реагент 5, 15:1 )	4,0	4,0
Образец, мл	---	0,01
Рабочий раствор 2, мл (дистиллированная вода, Реагент 3 и Реагент 4,   7:1:2 )	0,3	0,3
Смешать и измерить оптическую плотность опытной пробы и контрольной пробы против воды. Длина волны = 630 – 690 ни.

Расчет: В сыворотке: А=[(-)/]*66,6 мг/(с*л)

Нормальные величины: В сыворотке крови 3,3-8,9 мг/(с*л)

Клинико-диагностическое значение определения активности альфа-амилазы в крови и моче:

______________________________________________________________

______________________________________________________________

______________________________________________________________

Практическое занятие № 26

Тема занятия: «Проведение дифференциальной диагностики заболеваний печени по показателям активности ферментов. Диф. зачет»

Цели занятия:

·     рассмотреть основные методы определения активности ферментов, используемые в лабораторно – биохимических исследованиях дифференциальной диагностики заболеваний печени;

·     клинико- диагностическое значение изучения методик определения активности ферментов в сыворотке крови для диагностики заболеваний печени.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, полуавтоматические дозаторы, секундомер, термостат, ФЭК, кюветы.

Реактивы: набор для определения АсАТ, АлАТ, ЛДГ, Н2О

Выполнить определение вышеуказанных ферментов.

Вопросы для подготовки к дифференциальному зачету по разделам «Проведение лабораторных биохимических исследований по определению показателей белкового обмена» и «Проведение лабораторных биохимических исследований по определению активности ферментов»: 

Билет 1

1. Номенклатура ферментов

2. Алгоритм определения  каталитической активности  АсАТ в сыворотке крови

Билет 2

1. Катализ. Ферментный катализ

2. Алгоритм определения  каталитической активности  АлАТ в сыворотке крови.

 Билет 3

1. Уравнение Михаэлиса – Ментена

2. Алгоритм определения  активности  щелочной фосфатазы в сыворотке крови.

Билет 4

1. Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативных   реакций

2. Алгоритм определения  каталитической активности  КФК в сыворотке крови

Билет 5

1. Влияние температуры и рН на скорость ферментативных реакций.                                             

2. Алгоритм определения  каталитической активности  ЛДГ в сыворотке

Билет 6

1. Влияние активаторов и ингибиторов на скорость ферментативных     

                                               реакций

2.Унифицированный метод определения общей активности ЛДГ по оптимизированному оптическому тесту.

Билет 7

1. Специфичность ферментов

2. Унифицированный метод определения  каталитической активности  ᵧ ГТФ в сыворотке крови

Билет 8

1. Характеристика ферментативного катализа

2. Алгоритм определения  активности  кислой фосфатазы в сыворотке крови

Билет 9

1. Значение ферментов в медицине

2. Методы исследования активности ферментов

Билет 10

1. Энзимопатии и их виды.

2. Алгоритм определения  активности  ХЭ в сыворотке крови

Билет 11

1.            Свойства ферментов.

2. Алгоритм определения  активности  α-амилазы в сыворотке крови

Билет 12

1. Классификация ферментов.

2. Составить таблицу изомеров ЛДГ и указать их диагностическое значение.

Билет 13

1. Активный центр. Роль в ферментативном катализе.

2. Клинико – диагностическое значение определения ЛДГ

Билет 14

1. Химическая природа ферментов.

2. Клинико – диагностическое значение определения

 Билет 15

1. Простые ферменты и их представители

2. В ходе выполнения анализа определения активности трансаминаз в крови больного с инфарктом миокарда температура в термостате во время инкубации проб достигла 60° С. Как это отразится на результатах исследования?

Билет 16

1.  Обратимость  действия ферментов.

2.  Какому классу ферментов относят КФК?

Билет 17

1. Изоферменты

2. Пациенту с обострением хронического панкреатита назначено определение активности ферментов: α-амилазы крови и мочи, липазы крови. Пациент принес для анализа мочу, собранную накануне вечером. Можно ли определять активность фермента в моче, собранной накануне вечером?

Билет 18

1.Механизм действия ферментов.

2. Схема ферментативного гидролиза

Билет 19

1. Оксиредуктаза. Роль и представители.

2. Пациенту с подозрением на опухоль предстательной железы назначено определение активности кислой фосфатазы в крови. Забор пробы венозной крови проведен в 8 часов утра, в лабораторию кровь доставлена в 11 часов. Какие рекомендации следует дать пациенту по подготовке к исследованию?

Билет 20

1.             Лиазы. Роль и представители.

2.            В основе принципа определения  какого фермента применяют следующую реакцию:

 

Билет 21

1. Изомеразы. Роль и представители.

2. Пациенту с подозрением на опухоль предстательной железы назначено определение активности кислой фосфатазы в крови. Забор пробы венозной крови проведен в 8 часов утра, в лабораторию кровь доставлена в 11 часов.  Достоверен ли будет результат анализа? Обосновать ответ.

Билет 22

1. Лигазы. Роль и представители.

2. Утром в лабораторию из стационара поступила кровь больного с подозрением на сахарный диабет для определения содержания глюкозы, взятая накануне вечером. Достоверен ли будет результат анализа? Дать обоснование.  Как подготовить пациента к исследованию?

Билет 23

1. Неконкурентное ингибирование

2. Реакции, подтверждающие специфичность ферментов.

Билет 24

1. Коферменты.

2. Клинико – диагностическое значение определения АлАТ.

Билет 25

1.            Сложные ферменты и их представители

2. При проведении определения активности АсАТ было проведено измерение на фотоколориметре КФК-2, а для количественной оценки результатов была использована калибровочная таблица для фотоколориметра КФК-3. Можно ли выдавать результат исследования в этом случае?

Билет 26

1. Абсолютная специфичность. Привести примеры

2. Указать тип химической связи в субстрате, который расщепляет α - амилаза

 Билет 27

1. Конкурентное ингибирование.

2. Укажите величины активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови здоровых мужчин и женщин.

Билет 28

1.            Трансферазы. Роль и представители.

2. Назовите продукт реакции, по количеству которого судят об активности ЛДГ.

Билет 29

1. Гидролазы.  Роль и представители

2. Назовите заболевания, при которых повышается активность щелочной фосфатазы в крови человека

Билет 30

1. Энзимотерапия.

2. Укажите окраску индикатора с субстратом и продуктами   ферментативной реакции определения  α-амилазы.

Практическое занятие № 27

Тема занятия: «Количественное определение витамина С с 2,6-дихлорфенолиндфенолом».

Ход занятия:

Вопросы к устному фронтальному опросу:

1.      Приведите формулу витамина С

2.      Какова роль витамина С в синтезе адреналина?

3.      Какие обменные процессы стимулирует адреналин?

4.      По какому механизму действует адреналин?

5.      Какая аминокислота служит предшественником адреналина?

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки,  фарфоровой ступке, мерная колба, фильтровальная бумага, измельченное стекло, бюретки, секундомер.

Реактивы: ягоды шиповника, хвои, капусты, картофеля, 2% соляная кислота, 0,001н. р-р 2,6- дихлорфенолиндофенола, Н2О.

Принцип: количественного определения витамина С основан на его способности восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол, который в щелочной среде имеет синюю окраску, а в восстановленном состоянии бесцветный.  Количественное определение витамина С проводят, титруя исследуемый раствор, подкисленный соляной кислотой, щелочным раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола. Пока в титруемом растворе содержится витамин С, приливаемый щелочной раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола будет обесцвечиваться за счет образования восстановленной формы аскорбиновой кислоты. Как только все количество витамина С, имеющееся в исследуемом растворе, окислится, 2,6-дихлорфенолиндофенол не будет восстанавливаться и титруемый раствор приобретет розовую окраску за счет перехода щелочного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола синего цвета в 2,6-дихлорфенолиндофенол красного цвета в кислой среде.

Зная количество 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованное на титрование, и его титр, установленный по аскорбиновой кислоте, вычисляют содержание аскорбиновой кислоты в исследуемом растворе.

Ход работы: Точную навеску исследуемого материала  (сухих ягод шиповника - 1 г, хвои - 1 г, капусты - 5 г, картофеля - 5 г) тщательно растирают в фарфоровой ступке с 4 мл 2%-ной соляной кислоты, добавив немного измельченного стекла. Затем без потерь переносят содержимое ступки в мерную колбу на 25 мл, несколько раз смывая ступку водой и сливая ее по

стеклянной палочке в ту же колбу, и доводят объём раствора дистиллированной водой до метки. Полученную смесь оставляют на 5 - 10 мин. Содержимое колбы тщательно перемешивают, фильтруют через бумажный фильтр и фильтрат используют для определения витамина С. Экстракт, полученный из картофеля, не фильтруют.

Для титрования отмеривают в коническую колбочку определенный объем фильтрата (шиповника - 1 мл, хвои - 5 мл, капусты - 5 мл, картофеля 11- всю полученную смесь без фильтрации), добавляют 4 мл 2%-ного раствора соляной кислоты и титруют из бюретки 0,001н. раствором 2,6- дихлорфенолиндофенола до появления розового окрашивания, не исчезающего около 30 с. В контрольной пробе вместо вытяжки берется соответствующий объем смеси: 4 мл 2%-ной соляной кислоты и 21 мл воды.

Определение титра раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола.  В мерной колбе на 50 мл растворяют несколько кристалликов (1-1,5 мг) аскорбиновой кислоты в 2%-ной серной кислоте и доводят этой же кислотой до метки, тщательно перемешивают. В две конические колбочки берут по 5 мл приготовленного раствора аскорбиновой кислоты и после добавления кристалликов KJ (около 5 - 10 мг) и 5 капель 1%-ного раствора крахмала титруют одну колбочку 2,6-дихлорфенолиндофенолом, другую - точно 0,001 н. раствором KJO3 (0,03568 г KJO3 (йодноватокислый калий) растворяют в воде и доводят до 1 л). Расчет титра раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте ведут по формуле:

                                                       Т=0,088  х а /б,

где Т - количество миллиграммов аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола; 0,088 - количество мг аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл 0,001 н. раствора йодата калия;

а - количество мл 0,001 н. раствора йодата калия, израсходованного на титрование раствора аскорбиновой кислоты;

б - количество мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованное на титрование.

Расчет количества аскорбиновой кислоты в пробе производят по формуле:

       Х= T х A х B х100 /БхГ,

где Х - содержание аскорбиновой кислоты в миллиграмм-процентах;

Т - титр раствора 2 ,6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте,  т.е. это количество аскорбиновой кислоты (мг), соответствующее 1мл

раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола;

А - количество раствора 2 ,6-дихлорфенолиндофенола (мл), израсходованное на титрование, за вычетом контроля;

Б - количество мл вытяжки, взятое для титрования; В - обще количество вытяжки (мл);

Г - количество вещества в граммах, взятое для анализа; 100 - количество граммов исследуемого материала, взятое для вычисления процентного содержания.

Вывод:

Практическое занятие № 28

Тема занятия: «Проведение качественных реакций на стероидные и тиреоидные гормоны»

Цель занятия:

·     Изучить метод качественной реакции на гормон щитовидной железы (тироксин);

·     Изучить метод качественной реакции на обнаружения 17-кетостероидов в моче с помощью m-динитробензола

·     Изучить метод качественной реакции на фолликулин

·     Рассмотреть диагностическую роль определения стероидных и тиреоидных гормонов.

Ход занятия:

           Вопросы к устному фронтальному опросу:

1.     Какие это химические вещества «гормоны»?

2.     Классификация гормонов по химическому строению?

3.     Механизм действия гормонов?

4.     Гормоны щитовидной железы?

5.     Физиологическое действие гормонов щитовидной железы?

6.     Какие нарушения вызывает избыток гормонов щитовидной железы?

7.     Какие нарушения вызывает недостаток гормонов щитовидной железы?

8.     Стероидные гормоны?

9.     Женские половые гормоны?

10. Роль эстрогенов?

11. Роль прогестерона?

12. Мужские половые гормоны?

13. Понижение уровня мужских половых гормонов приводит к …?

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, ФЭК, полуавтоматические анализаторы, секундомеры, водяная баня,  .

Реактивы: моча, 10 и 30% р-ры едкого натрия, 2% спиртового раствора m-динитробензола, спиртовый р-р кортизола, гидроксид тетраметиламмония и р-р синего тетразолия, спиртовоый р-р фолликулина,  к. р-р серной кислоты, 3% р-р хлорида железа (ΙΙΙ), р-р адреналина, сульфаниловая кислота, р-р нитрита натрия, р-р адреналина, 1% р-р йодида калия, 10% р-р уксусной кислоты.

Качественное обнаружение 17- кетостероидов в моче с помощью

                     m-динитробензола (в плазме крови 0,14-0,55 ммоль/л):

В пробирку размещают 5 капель мочи, 5 капель 30% раствора едкого натрия и 5 капель 2% спиртового раствора m-динитробензола (в этаноле); перемешивают. при состоянии появляется красное окрашивание за счет образования продуктов конденсации циклопентанпергидрофенантрена с m- динитробензолом.

Качественная реакция на кортизол:

К 1 мл спиртового раствора кортизола добавляют 0,25 мл раствора гидроксида тетраметиламмония и 0,25 мл раствора синего тетразолия. Содержимое пробирки встряхивают и оставляют в темноте на 25 минут; жидкость окрашивается в розовый цвет.

Реакция используется при колориметрическом методе для количественного определения содержания кортикостероидов в биологических жидкостях и основана на восстановления синего тетрозолия за счет оксикетонной группы у 17-го углеводного атома циклопентанпергидрофенантреного ядра.

(в плазме утром 138-615,   вечером 82-441 нммоль/л.)

                      Качественная реакция на фолликулин (эстрон) с            

                           концентрированной серной кислотой.

В маленькую пробирку наливают 20 капель спиртового раствора фолликулина и помещают ее в кипящую водяную баню на 5-10 минут для удаления спирта. К оставшемуся в пробирке фолликулину добавляют 20 капель концентрированной серной кислоты и помещают пробирку вновь в кипящую водяную баню на 5-10 минут. Появляется соломенно- желтое окрашивание, переходящее при нагревании в оранжевое и имеющее зеленую флюоресценцию. С масляным раствором фолликулина реакцию проводят при комнатной температуре.

Качественные реакции обнаружения адреналина

 Опыт 1. Реакция с хлоридом железа (ΙΙΙ).

В пробирку вносят 10 капель раствора адреналина (1:1000), прибавляют 1 каплю 3%-ного раствора FeCl3 и перемешивают. Появляется изумрудно-зеленое окрашивание, затем добавляют 1 каплю 10%-ного раствора NaOH–возникает вишнево-красное окрашивание.  

Опыт 2. Реакция с диазореактивом. К 6 каплям раствора сульфаниловой кислоты прибавляют 6 капель раствора нитрита натрия (диазореактив), 10 капель раствора адреналина и 3 капли 10%-ного раствора гидроксида натрия. Жидкость окрашивается в красный цвет.

 Опыт 3. Реакция на адреналин с йодидом калия. К 5 каплям адреналина прибавляют 10 капель 1%-ного раствора йодида калия и 10 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты. Смесь осторожно подогревают до 60-650С. Появляется интенсивное красно-фиолетовое окрашивание.  Качественные реакции обнаружения инсулина 

Клинико-диагностическое значение определения стероидных и тиреоидных гормоны: ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________

Практическое занятие № 29

Тема занятия: «Обнаружение лактозы и мальтозы»

Цель занятия:

·               Изучить методы обнаружения лактозы и мальтозы

·               Рассмотреть роль лактозы и мальтозы  в организме человека

Ход занятия:

Вопросы к устному фронтальному опросу:

1.            Что такое лактоза?

2.            Химические свойства лактозы?

3.            Что означает термин «непереносимость лактозы»?

4.            Роль лактозы в организме человека?

5.            Основные функции лактозы?

6.            Что такое мальтоза?

7.            Свойства мальтозы?

8.            Дефицит мальтозы в организме вызывает...?

9.            Признаки передозировки мальтозы в организме?

10.        Принцип обнаружения лактозы?

11.        Принцип обнаружения мальтозы?

12.        Какая связь между двумя молекулами моносахаридов при образовании дисахаридов?

13.        Что входит в состав женского молока?

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, секундомеры, дозаторы, водяная баня,  .

Реактивы: аммиак водный, концентрированный; 20% р-р КОН; моча; 1% р-р лактозы; 1% р-р мальтозы, р-р Биаля.

Принцип метода: Лактоза и мальтоза с аммиаком в щелочной среде образуют при нагревании окрашенные соединения 

Ход работы:

В 3 пробирки: 1-ю – внести 5 мл мочи, 2-ю – 5 мл раствора лактозы, 3-ю – 5 мл раствора мальтозы и прибавить во все пробирки по 2,5 мл раствора аммиака, по 0,2 мл КОН и нагреть на водяной бане 30 минут при 60°С. При наличии лактозы через несколько минут появляется коричневая окраска, при наличии мальтозы – красное окрашивание.

В моче здорового человека лактоза и мальтоза не обнаруживается.

Качественные реакции на углеводы позволяет определить их присутствие в различных биологических жидкостях и провести дифференциацию моно-, ди-, полисахаридов.

Обнаружение пентоз (проба Биаля)

Принцип: Пентозы с орцином и треххлористым железом в кислой среде образует при нагревании соединения жёлто-зелёного цвета.

Ход определения: 5 мл. раствора Биаля смешивают с 1 мл. мочи (1 пробирка) и раствора пентозы ( 2 пробирка), нагревают до кипения. При положительной реакции появляется желто0-зеленое окрашивание. В моче здорового человека пентозы не обнаруживаются.

Клинико-диагностическое значение определения лактозы и мальтозы: Качественные реакции на углеводы позволяет определить их присутствие в различных биологических жидкостях и провести дифференциацию моно-, ди-, полисахаридов. ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________     

Практическое занятие № 30

Тема занятия: «Проведение качественных реакции на глюкозу»

Цель занятия:

·               Изучить методы проведение качественных реакций на глюкозу

·               Рассмотреть роль глюкозы в организме человека

Ход занятия:

Вопросы к устному фронтальному опросу:

1.                 Химический состав глюкозы?

2.                 Качественная реакция глюкозы с гидроксидом меди?

3.                 Качественная реакция глюкозы с аммиачным раствором оксида серебра?

4.                 Роль глюкозы в организме человека?

5.                 Какой гормон необходим для усвоения глюкозы?

6.                 Что происходит при избыточном поступлении глюкозы в организм?

7.                 Какие органы, ткани и клетки используют глюкозу?

8.                 Основная форма хранения глюкозы в организме?

9.                 Какие низкомолекулярные углеводы присутствуют в организме человека?

10.            Когда происходит использование глюкозы в организме?

11.             Функции глюкозы в организме?

12.            Избыток глюкозы в организме?

13.            Структурная формула глюкозы?

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, ФЭК, полуавтоматические анализаторы, секундомеры.

Реактивы: р-р глюкозы, р-р щелочи и сульфата меди (II),

Принцип: Молекула глюкозы содержит 5 гидроксильных групп и 1 альдегидную. Поэтому она проявляет свойства как многоатомных спиртов, так и альдегидов, и относится к группе альдегидоспиртов.

Взаимодействие глюкозы с гидроксидом меди (II) демонстрирует восстановительные свойства глюкозы.

Ход определения. В пробирку с раствором глюкозы в небольшом количестве добавляется раствор щелочи и сульфата меди (II). Раствор приобретает характерный ярко-синий окрас. Образовался гидроксид меди (II), с которым тут

же реагирует глюкоза. Глюкоза в этой реакции реагирует как многоатомный спирт с образованием комплексных соединений сCu²⁺.

Далее раствор в пробирке нагревается. Реакция глюкозы с гидроксидом меди при нагревании демонстрирует восстановительные свойства глюкозы. Происходит изменение - окрашивания раствора.

При нагревании реакция глюкозы с гидроксидом меди(II) идет с восстановлением двухвалентной меди Cu (II) до одновалентной меди Cu (I). В начале выпадает осадок оксида меди CuO желтого цвета. В процессе дальнейшего нагревания CuO восстанавливается до оксида меди (I) – Cu₂O, который выпадает в виде красного осадка. В процессе этой реакции глюкоза окисляется до глюконовой кислоты. Уравнение данной ОВР:

2 HOСН₂ - (СНOH)₄) – СН=O + Cu(OH)₂ = 2HOСН₂ - (СНOH)₄) - СOOH + Cu₂O + 2 H₂O

Это качественная реакция глюкозы с гидроксидом меди на альдегидную группу.

Качественная реакция на глюкозу с аммиачным раствором оксида серебра (I).

Наличие альдегидной группы в глюкозе можно доказать, используя аммиачный раствор оксида серебра. Раствор глюкозы добавим к аммиачному раствору оксида серебра, а затем подогреем полученную смесь на водяной бане. Через небольшой промежуток времени на стенках колбы будет осаждаться металлическое серебро. Реакция эта называется реакцией серебряного зеркала и используется как качественная для выявления альдегидов. Альдегидная группа глюкозы окисляется до карбоксильной группы. При этом глюкоза окисляется до глюконовой кислоту.

СН2ОН – (СНОН)4 – СОН + Ag2O = СН2ОН – (СНОН)4 – СООН + 2Ag↓

Качественная реакция на глюкозу серебряного зеркала применяются в промышленности с целью серебрения зеркал, для изготовления елочных украшений, колб для термосов.

Хранить аммиачный раствор оксида серебра нельзя. После проведения опытных работ неиспользованный раствор оксида серебра нейтрализуют соляной кислотой.

Реакция крахмала с йодом.    Широко известна очень чувствительная цветная реакция крахмала — это йодная реакция раствор йода (с йодистым калием) вызывает интенсивное синее окрашивание растворов крахмала. Характерно, что это окрашивание исчезает при кипячении раствора и вновь появляется при его охлаждении. Реакция крахмала и йода очень чувствительна, и при высоких

концентрациях исходных продуктов окраска получается очень темной, почти черной. Поэтому чтобы наблюдать синюю окраску, реакцию следует проводить с сильно разбавленными реактивами. Осахаривание крахмала производят кислотным или ферментативным путем. При кислотном гидролизе крахмал кипятят с 2,7—3%-ным раствором серной кислоты до полного осахаривания, определяемого по отрицательной реакции с йодом. Серную кислоту затем нейтрааизуют мелом или известковым молоком.

    Различная окраска при реакции с йодом, а следовательно, различная степень гидролиза крахмала обусловлены разной скоростью ферментативного катализа при разных температурных условиях опыта. Максимальная скорость ферментативной реакции наблюдается при температуре 45°, а минимальная— при температуре О и 75°. Приготовление 1%-ного раствора крахмала (субстрат). 1 г растворимого картофельного крахмала с учетом влажности помещают в мерную Колбу вместимостью 100 мл, добавляют 25 мл воды и перемешивают до исчезновения комочков. Затем добавляют в колбу еще 25 мл воды, помещают колбу с содержимым в кипящую водяную баню и выдерживают в ней при непрерывном перемешивании до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 мл ацетатного буферного раствора с pH 4,7 (для препаратов грибного происхождения) или фосфатного буферного раствора с pH 6,0 (для препаратов бактериального происхождения), объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой и содержимое колбы перемешивают. Полученный субстрат после реакции с йодом должен иметь окраску, оптическая плотность которой ие менее 0,70. Его можно использовать в течение 10 сут при условии хранения в холодильнике. В этом случае каждый день перед использованием субстрат нагревают в кипящей водяной бане в течение 5—10 мин. С помощью йода удаётся открывать самые незначительные количества крахмала.

Вывод: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________     

Практическое занятие № 31

Тема занятия: «Определение концентрации молочной кислоты»

Цель занятия:

·               Изучить методы определение концентрации молочной кислоты

·               Рассмотреть роль молочной кислоты  в организме человека

Ход занятия:

Вопросы к устному фронтальному опросу:

1.                 Молочная кислота – это продукт…?

2.                 Какой биоматериал можно использовать для исследования?

3.                 Какой метод исследования применяется для определения молочной кислоты?

4.                 Как правильно подготовиться к исследованию?

5.                 Для чего используется исследование?

6.                 Что может влиять на результат?

7.                 Причины повышения уровня молочной кислоты?

8.                 Причины понижения уровня молочной кислоты?

9.                 О чем необходимо помнить при повышенном уровне молочной кислоты?

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, ФЭК, полуавтоматические дозаторы, секундомеры, центрифуга.

Реактивы: сыворотка крови, 0,6 М р-р хлорной кислоты,

Принцип: Определение молочной кислоты основано на реакции катализируемой ЛДГ и тесте-Варбурга – спектрофотометрической регистрации прироста НАДН при длине волны 340 нм, эквимолярному окисленной молочной кислоте.

Ход работы:

1.Этап. Получение безбелкового экстракта молочной кислоты.

В центрифужную пробирку отмерить 0,5 мл крови (сыворотки) и 1 мл 0,6 М хлорной кислоты. Через 5 мин. инкубации осадить белки центрифугированием при 5 тыс.об/мин., в течение 5 минут. Полученную надосадочную жидкость слить в чистую пробирку и использовать для исследования в следующем этапе.

2.Этап. Запуск реакции и инкубирование.

Приготовить реакционную смесь

                 Приготовление реакционной смеси

Реагенты (мл).	Пробирки
Опыт	Контроль
Буферный раствор	2,0	2,0
Хлорный экстракт	0,2	-
Р – р. НАД	0,1	0,1
Р – р. хлорной кислоты	-	0,2

Инкубирование провести в термостате при 39 градусах, в течение 30 минут.

3.Этап. Спектрофотометрирование.

Содержимое пробирок опыта и контроля поочередно перелить в чистые кюветы и снять показания экстинций с прибора при длине волны 340 нм, против воздуха.

4.Этап. Расчет: Еоп – Ек = DЕ

С ммоль/л = DЕ х 10535, где 10535 – коэффициент пересчета в ммоль/л.

В нормальной венозной сыворотке крови содержание молочной кислоты находится в пределах – 0,6 – 1,6 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение определения молочной кислоты: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________     

Практическое занятие № 32

Тема занятия: «Проведение экспресс метода определения глюкозы»

Цель занятия:

Образовательные:

·               Изучить  экспресс методы определения глюкозы

·               Рассмотреть распад глюкозы в организме человека

Ход занятия:

Большое распространение начали получать переносные, портативные аппараты для экспресс-диагностики больного. Примером такого медицинского оборудования является глюкометр. Его приобретает практически каждый человек, страдающий заболеванием сахарный диабет. С помощью глюкометра человек может определить количество глюкозы в крови на данный момент. При этом приобрести его достаточно просто и непроблематично: купить можно в любой аптеке.

Сдать анализ крови можно и с помощью особых тестовых полосок. Стоит отметить, что такой метод диагностирования довольно распространен и популярен. Благодаря его осуществлению определяют глюкозу. Показатель содержания сахара в крови крайне важен для точного и своевременного выявления сахарного диабета и контроля за протеканием заболевания.

Нужно помнить, что тест действителен на протяжении нескольких часов, так как содержание глюкозы в крови меняется в зависимости от приема пищи.

Для ориентировочного определения содержания сахара крови экспресс-методом применяются диагностические бумажки: декстронал (ГДР), декстростикс (Англия). Тест основан на глюкозооксидазной методике. Каплю крови наносят на диагностическую бумажку, через минуту смывают ее дистиллированной водой и определяют содержание сахара по колориметрической шкале. Точность методики в пределах ±30—40 мг%, исследование возможно только при отсутствии повышенной кетонемии.

Для быстрого определения сахара в моче предложен также ряд диагностических бумажек, в большинстве основанных на глюкозооксидазной методике: глюкотест (СССР), клинистикс, лабстикс, биофак Г и др.

Реактивные бумажки глюкотест представляют собой полоску бумаги размером 0,5X5 см, имеющую поперечную полоску светло-желтого цвета, пропитанную раствором ферментов и красителей. С помощью этой полоски можно определить содержание сахара в моче как качественно, так и полуколичественно от 0,1 до 2% и выше. Метод основан на окислении глюкозы с помощью фермента глюкооксидазы. Изменение окраски свидетельствует о присутствии глюкозы в моче.

Для определения глюкозы в моче диагностическую бумажку погружают в мочу так, чтобы цветная полоса была смочена мочой, немедленно извлекают и помещают на пластмассовую пластинку на 2 мин. Далее сравнивают изменившуюся окраску поперечной полоски с цветной шкалой, имеющейся в комплекте. Содержание сахара в моче читают около деления с наибольшим совпадением цвета.

Рекомендуется исследовать свежую мочу, полученную до приема пищи. Диагностические полоски следует хранить при температуре от 8 до 13°С, защищая от солнечных лучей, нельзя дотрагиваться до поперечной полосы руками.

Наиболее точное количественное определение глюкозы в моче обеспечивает поляриметр.

Практическая часть

Экспресс - методы определения глюкозы в биологических жидкостях человека.

Для полуколичественной, скрининговой оценки содержания глюкозы в крови и мочи в настоящее время широко используется тест- полоски.

Тест- полоски представляет собой полоску витамина для другого полимерного материала, на которую наклеен аналитический элемент в виде квадрата светло- желтого, светло розового или светло- бежевого цвета, выполненный из фильтрующего материала. Элемент пропитывается активным раствором Глюкоза под влиянием глюкозоксидазы или дегидрирогеназы окисляется с выделением эквивалентного количества перекиси водорода, который при участии пероксидазы реагирует с красителями на анатомическом элементе, изменяя их окраску: желтый переходит в зеленый, розовый – в красный, бежевый в синий. Возникшую окраску сравнивают с одним из участников цветной гаммы шкалы, нанесенной на поверхности футляра, в котором хранятся сами тетс-полоски. Виды тест- полосок: «Глюко – уротест» - для определения и обнаружения глюкозы в моче; диагностические полоски «ФАН» - для полуколичественного определения глюкозы в крови ( от 1 до 44ммоль/л) ; индекаторные полоски «БМ-Тест 1-44РФ», «Гемо –Глюкотест» - для определения концентрации глюкозы в крови; «Глюкостикс» и многие другие.

Ход работы: На тест-полоску наносят каплю крови или погружают на 1- 2 секунды в мочу. Избыток мочи удаляется, проведя гранью полоски по краю сосуда. Выдерживают на воздухе примерно 1-2 минуты и визуально сравнивают окраску аналитического элемента со стандартной окраской на поверхности пенала (футляра), в котором хранятся полоски.

Для получения правильных результатов исследования следует соблюдать 2 правила.

1) Не прикасаться руками к аналитической зоне тест- полоски и не допускать попадания на нее прямых солнечных лучей ;

2) Хранить тест-полоски в герметической таре (футляре)в сухом прохладном месте, ноне в холодильнике; избегать воздействия влаги, высокой температуры и действия различных химических веществ.

Практическое занятие № 33

Тема занятия: «Определение концентрации глюкозы в крови»

Цель занятия:

·               Изучить метод определения концентрации глюкозы в крови

·               Рассмотреть диагностическую роль определения концентрации глюкозы в крови

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, ФЭК, полуавтоматические анализаторы, секундомеры.

Реактивы: набор для определения глюкозы в крови

Принцип метода:

B,D-глюкоза+ АТФ ßГексокиназа àглюкозо-6-фосфат +АДФ;

Глюкозо-6-фосфат +НАДß глюкозо-6-фосфат-дегидрогиназаà глюконат-6-фосфат+ НАД.

Количество образовавшегося НАДН пропорционально концентрации глюкозы в исследуемом образце. Данный метод обладает 100% специфичностью по отношению к B, D-глюкоза, так как глюкозо-6-фосфат-дегидрогиназа взаимодействует исключительно глюконат-6-фосфатом.

Алгоритм определения

Внести в кювету	Опытная проба	Калибратор	Контроль на реакт.
Рабочий реагент, мкл	1000	1000	1000
Исследуемый образец, мкл	10	-	-
Калибратор, мкл	-	10	-
Вода, мкл	-	-	10
Смешать и инкубировать 5 минут при температуре 31 С при 10 минут при температуре 18-25 С. По окончании инкубации измерить оптическую плотность пробы и калибратора против контроля на реактивы, при длине волны=340 нм и диметр кюветы = 1 см. Окраска стабильна в течении 30 минут.

Расчет:

В сыворотке (плазме) крови, моче, ликворе:

С=5,55Х  (ммоль/л)

Референтные пределы:

 Сыворотка крови – 4,1-5,9 ммоль/л; моча – 0,1-0,8 ммоль/л; ликвор- 2,2-3,9 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение определения глюкозы в крови и моче : __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________     

Практическое занятие № 34

Тема занятия: «Исследования функции поджелудочной железы методом сахарной нагрузки»

Цель занятия:

·               Изучить метод исследования функции поджелудочной железы методом сахарной нагрузки

·               Рассмотреть диагностическую роль метода исследования функции поджелудочной железы методом сахарной нагрузки

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, ФЭК, полуавтоматические дозаторы, секундомеры, маркер.

Принцип:

Клинико-диагностическое значение исследования функции поджелудочной железы методом сахарной нагрузки: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Практическое занятие № 35

Тема занятия: «Определение концентрации пировиноградной кислоты в сыворотке крови»

Цель занятия: освоить методы определения мочевой кислоты в сыворотке крови.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, ФЭК, полуавтоматические дозаторы, секундомеры, маркер.

Реактивы: набор для определения ПВК, Н2О

Принцип: Потребность в ее определении обусловлена тем, что недостаток в организме витамина B1 ведет к нарушению углеводного обмена и накоплению в организме пировиноградной кислоты. Поэтому обнаружение у больного большего, чем в норме, количества пировиноградной кислоты можно с известными оговорками оценивать, как признак гиповитаминоза В1. Пировиноградная кислота во время реакции с 2,4-ДНФГ создает гидразон, который увеличивается в щелочной среде имеет коричневое окрашивание. Интенсивность окраски пропорциональна содержимому пировиноградной кислоты в сыворотке крови.

Алгоритм определения

Реактив	Проба, мл	Холостая, мл
Капилярная кровь	0,3	-
Дист/вода	0,7	1

Перемешиваем стек/палочкой до полного гемолиза эритроцитов

ТХО

1

1

Смешиваем стек/палочкой, выдерживая на протяжении 2-3 мин и йентрифугируют со скростью 1500 об/мин 15 мин

Центрифугат	1,8	1,8
ДНФГ	0,4	0,4

Смешиваю выдерживают напротяжении 20 мин в темном месте

Р-р натрия гидрооксид

1

1

ДНФГ- денитрофенилгидрозин. Смешиваю выдерживают на протяжении 5 мин и колориметрируют в кюветах толщиной 5 мм с синим светофильтром и длинной волны 540 Нм против холостой пробы.

Норма концентрации пировиноградной кислоты в сыворотке крови 34,07-102,2 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение определения ПВК: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________     

Практическое занятие № 36

Тема занятия: «Определение концентрации сиаловых кислот в сыворотке крови»

Цель занятия:

·               Изучить метод определения концентрации сиаловых кислот в сыворотке крови

·               Рассмотреть диагностическую роль определения сиаловых кислот в сыворотке крови

Ход занятия:

Для определения концентрации сиаловых кислот в сыворотке крови обычно используется колориметрический метод Гесса. При этом безбелковый фильтрат сыворотки крови подвергают гидролизу, в результате чего из состава сиалогликопротеидов выделяются сиаловые кислоты, которые взаимодействуя с уксусной и серной кислотами в условиях повышенной температуры, создаваемой в кипящей водяной бане, дают окрашенные соединения, изменяющие цвет раствора в буровато-розовый или красно-фиолетовый. При этом интенсивность окрашивания зависит от концентрации сиаловых кислот.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, ФЭК, полуавтоматические дозаторы, секундомеры, маркер.

Реактивы: набор для определения сиаловых кислот, Н2О

Ход определения. В центрифужную пробирку наливают 1 мл сыворотки крови и, осторожно встряхивая, добавляют 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирку помещают на 5 минут в кипящую водяную баню, затем охлаждают обычно путем выдерживания ее в течение 5 минут в ледяной бане или холодной воде, центрифугируют 5 минут при 1000-2000 об/мин. К 0,4 мл отобранной надосадочной жидкости добавляют 5 мл уксусно-сернокислой смеси и пробы повторно нагревают в кипящей водяной бане в течение 30 минут. При этом бесцветный раствор постепенно приобретает красно-фиолетовый цвет. После охлаждения в ледяной бане или под струей холодной воды пробы колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете с шириной слоя 10 мм. В качестве контроля используют 5% раствор серной кислоты в ледяной уксусной кислоте.Результат выражают либо в условных единицах (при отсутствии стандартного раствора), для чего полученную величину экстинкции

умножают на 1000, либо в значениях концентрации ацетилнейраминовой кислоты. В последнем случае расчет ведут по калибровочному графику.   К растворам прибавляют 5 мл уксусно-сернокислого реактива и обрабатывают их так же, как опытные пробы. Построение калибровочного графика. Из основного стандартного раствора N-ацетилнейраминовой кислоты готовят рабочие растворы. В норме содержание сиаловых кислот составляет 135-200 усл.ед., или 62-73 мг% (0,62-0,73 г/л), или 2,00-2,36 ммоль/л N-ацетилнейраминовой кислоты.

Клинико-диагностическое значение определения сиаловых кислот: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________     

Практическое занятие № 37

Тема занятия: «Определение гаптоглобина в сыворотке крови»

Цель занятия

·               Изучить метод определения гаптоглобина в сыворотке крови (метод Каринека)

·               Рассмотреть диагностическую роль определения гаптоглобина в сыворотке крови

Гаптоглобин — это альфа-2-гликопротеин (альфа-2-глобулин), синтезируемый в печени, который прочно связан с гемоглобином. Комплексы гаптоглобин-гемоглобин также, как и сам свободный гаптоглобин, играют важную роль в сохранении железа и предупреждении возможного повреждения почек вследствие экскреции гемоглобина. Как белок острой фазы, гаптоглобин повышается при наличии воспалительного процесса, тканевого некроза или малигнизации. Дефицит гаптоглобина в плазме есть следствие гемолиза «in vivo», присутствия эстрогенов при беременности и приеме оральных контрацептивов, а также при большинстве форм острых и хронических гепатоклеточных заболеваний, включая вирусные гепатиты. Тест на гаптоглобин, в основном, используется для определения и мониторинга гемолитических расстройств. При нормальных состояниях примерно 1% циркулирующих эритроцитов разрушается при циркуляции. Увеличение деструкции всего лишь до 2% в день будет полностью расходовать плазменный гаптоглобин при отсутствии стимулов к его продукции. Продукция гаптоглобина стимулируется действием гормона роста, инсулина, эндотоксинов бактерий, простагландинов и цитокинов, но не гемолизом или снижением уровня гаптоглобина. Пик повышения наблюдается на 4–6 день после стимуляции; снижение до нормального уровня — в течение 2 недель после удаления стимулирующих факторов. Внесосудистый гемолиз обычно не приводит к изменению концентрации гаптоглобина. Определение концентрации гаптоглобина используется, в основном, для скрининга гемолитических заболеваний. Для исключения влияния гемолиза на результаты определения гаптоглобина их необходимо анализировать в сопоставлении с данными хотя бы еще одного показателя острой фазы.

Практическая часть

Оснащение: пипетки, пробирки, ФЭК, полуавтоматические дозаторы, секундомеры, маркер.

Реактивы: набор для определения сиаловых кислот, Н2О

Принцип: Определение остатка гемоглобина (Hb), не осаждающегося из сыворотки при действии на нее риванола – реактива, избирательно преципитирющего комплекс гемоглобин-гаптоглобин.

Алгоритм определения:

Отмерить, мл	Опытная проба	Контрольная проба		Стандартная проба
Исследуемая сыворотка ( без следов гемолиза)	0,5	0,5		-
Рабочий раствор гемоглобина	0,2	-		0,2
Дистиллированная вода	0,3	0,5		2,8
Для образования комплекса Hb – Hp пробы выдерживают в течении 10 мин. При комнатной температуре.
Риванол	2,0		2,0		-
Опытную и контрольную пробы перемешивают и через 5 мин. центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость переливают в другие пробирки и далее в них и в пробирку со стандартным раствором добавляют по 0,2 мл раствора сульфата аммония (используемого для растворения белка).

Все пробы выдерживают в течении 1 ч при комнатной температуре, после чего фотометрируют на ФЕКе при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм) в кювете с длиной оптического пути 10 мм (при необходимости под дно кюветы подложить стеклянную пластинку).

Расчет результатов выполняют по формуле:

C(г/л) –  х2,

Где С – концентрация гаптоглобина в пробе, Аоп – абсорбция (экстинция) опыта; Ак – абсорбция контрольной пробы; Аст – абсорбция стандарта.

При высоком уровне гаптоглобина в пробу вносят 0,4 мл раствора гемоглобина. При этом вместо коэффициента 2 используют 4.

Норма. У практически здоровых людей содержание гаптоглобина, определенное данным методом, составляет 0,8 – 1,9 г/л.

При малейшем подозрении на гемолиз ( хотя бы слабый) уровень Hp в сыворотке определять не следует.

Клинико-диагностическое значение определения гаптоглобина: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________     

Практическое занятие № 38

Тема занятия: Контрольный срез

Цель занятия:  Проведение контроля уровня усвоения материала по разделу «Витамины. Гормоны. Углеводы»

Ход занятия: тест и разбор ошибок.