Получение стволовых клеток. Дифференцировочный потенциал взрослых стволовых клеток

• 1 слайд

  Получение взрослых стволовых клеток
  Стволовые клетки можно разделить на три основные группы в зависимости от источника их получения: эмбриональные, фетальные (плодные, после аборта) и постнатальные (стволовые клетки взрослого организма)
  Дифференцировочный потенциал взрослых стволовых клеток
  Подготовила: Прокофьева Е.С.
  
  

• 2 слайд

  Постнатальные стволовые клетки
  
  обладают меньшей потентностью
  этический аспект их исследования и применения не вызывает серьёзной полемики
  возможность использования аутогенного материала обеспечивает эффективность и безопасность лечения
  Потентность (стволовая клетка) — потенциал стволовых клеток к развитию в те или иные клеточные линии
  

• 3 слайд

  Стволовые клетки взрослого организма можно подразделить на три основных группы:
  -гемопоэтические (кроветворные),
  -мультипотентные мезенхимальные (стромальные)
  - тканеспецифичные прогениторные клетки.
  Иногда в отдельную группу выделяют клетки пуповинной крови, поскольку они являются наименее дифференцированными из всех клеток зрелого организма[источник не указан 1795 дня], то есть обладают наибольшей потентностью. Пуповинная кровь в основном содержит гемопоэтические стволовые клетки, а также мультипотентные мезенхимальные, но в ней присутствуют малые количества других разновидностей стволовых клеток, при определённых условиях способные дифференцироваться в клетки различных органов и тканей.
  

• 4 слайд

• 5 слайд

• 6 слайд

  Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК)
  Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) — мультипотентные стволовые клетки, дающие начало всем клеткам крови миелоидного (моноциты, макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты и тромбоциты, дендритные клетки) и лимфоидного рядов (Т-лимфоциты, В-лимфоциты и естественные киллеры).
  Гемопоэтическая ткань содержит клетки с долгосрочными и краткосрочными возможностями к регенерации, включая мультипотентные, олигопотентные и клетки-предшественники.
  ГСК являются неоднородной популяцией
  Три субпопуляции ГСК, в соответствии с пропорциональным отношением лимфоидного потомства к миелоидному (Л/M).
  (У миелоидно ориентированных ГСК низкое Л/М соотношение (>0, <3), у лимфоидно ориентированных — высокое (>10).,«сбалансированных» ГСК, для которых 3 ≤ Л/M ≤ 10.)
  Промежуточные результаты показывают, что только миелоидно ориентированные и «сбалансированные» ГСК способны к продолжительному самовоспроизведению.
  Эксперименты по трансплантации показали, что каждая группа ГСК преимущественно воссоздаёт свой тип клеток крови, что позволяет предположить наличие наследуемой эпигенетической программы для каждой субпопуляции.
  Популяция ГСК формируется во время эмбриогенеза. У млекопитающих- в областях мезодермы, называемых аорта, гонада и мезонефрос, до формирования костного мозга популяция расширяется в фетальной печени.
  Основным источником ГСК является. костный мозг, включая тазовые кости, рёбра, грудину .
  Клетки могут быть получены непосредственно из тазовых костей при помощи иглы и шприца или из крови, после предварительной обработки цитокинами, включая G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), способствующий выходу стволовых клеток из костного мозга.
  
  

• 7 слайд

• 8 слайд

  Мультипотентные мезенхимальные (стромальные) клетки
  
  - способны дифференцироваться в остеобласты (клетки костной ткани), хондроциты (хрящевые клетки) и адипоциты (жировые клетки)
  Предшественниками ММСК в эмбриогенный период развития являются мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Они могут быть обнаружены в местах распространения мезенхимы, то есть зародышевой соединительной ткани.
  Основным источником ММСК является костный мозг. Кроме того, они обнаружены в жировой ткани и ряде других тканей с хорошим кровоснабжением — вокруг кровеносных сосудов. Кроме того, в пульпе молочных зубов, амниотической (околоплодной) жидкости, пуповинной крови и вартоновом студне.
  
  

• 9 слайд

  В 2005—2006 г. определили ряд параметров, которым должны соответствовать клетки, чтобы отнести их к популяции ММСК. Статьи - представлен иммунофенотип ММСК и направления ортодоксальной дифференцировки(в клетки костной, жировой и хрящевой тканей) Ряд экспериментов по дифференцировке ММСК в нейроноподобные клетки, но исследователи по-прежнему сомневаются, что полученные нейроны являются функциональными. Эксперименты по дифференцировке ММСК в миоциты.
  Область клинического применения ММСК является которансплантация совместно с ГСК в целях улучшения приживления образца костного мозга или стволовых клеток пуповинной крови.
  Многочисленные исследования показали, что ММСК человека могут избегать отторжения при трансплантации, вступать во взаимодействие с дендритными клетками и Т-лимфоцитами и создавать иммуносупрессивную микросреду посредством выработки цитокинов. Иммуномодулирующие функции ММСК человека повышаются, когда их пересаживают в воспалённую среду с повышенным уровнем гамма-интерферона. Другие исследования противоречат этим выводам, что обусловлено гетерогенной природой изолированных МСК и значительными различиями между ними, в зависимости от способа культивирования.
  МСК могут быть активированы в случае необходимости. Однако эффективность их использования относительно низка. Так, к примеру, повреждение мышц даже при трансплантации МСК заживает очень медленно. В настоящее время проводятся исследования по активации МСК. Ранее проведённые исследования по внутривенной трансплантации МСК показали, что этот способ трансплантации часто приводит к кризу отторжения и сепсису. Сегодня признано, что заболевания периферических тканей, например, воспаление кишечника лучше лечить не трансплантацией, а методами, повышающими локальную концентрацию МСК.
  Однако, исследования эффективности применения МСК для реэпителизации поврежденных кожных покровов, например, при синдроме диабетической стопы, показали свою результативность в клинических исследованиях.
  
  

• 10 слайд

  Тканеспецифичные прогениторные клетки
  
  Тканеспецифичные прогениторные клетки (клетки-предшественницы) — малодифференцированные клетки, которые располагаются в различных тканях и органах и отвечают за обновление их клеточной популяции, то есть замещают погибшие клетки.
  К ним относятся миосателлитоциты (предшественники мышечных волокон), клетки-предшественницы лимфо- и миелопоэза. Эти клетки являются олиго- и унипотентными и их главное отличие от других стволовых клеток в том, что клетки-предшественницы могут делиться лишь определённое количество раз, в то время как другие стволовые клетки способны к неограниченному самообновлению. Их принадлежность к истинно стволовым клеткам подвергается сомнению.
  Отдельно исследуются нейральные стволовые клетки, которые также относятся к группе тканеспецифичных. Они дифференцируются в процессе развития эмбриона и в плодный период, в результате чего происходит формирование всех нервных структур будущего взрослого организма, включая центральную и периферическую нервные системы. Эти клетки были обнаружены и в ЦНС взрослого организма, в частности, в субэпендимальной зоне, в гиппокампе, обонятельном мозге и т. д. Несмотря на то, что большая часть погибших нейронов не замещается, процесс нейрогенеза во взрослой ЦНС всё-таки возможен за счёт нейральных стволовых клеток, то есть популяция нейронов может «восстанавливаться», однако это происходит в таком объёме, что не сказывается существенно на исходах патологических процессов.
  
  

• 11 слайд

  Индуцированные плюрипотентные клетки
  Плюрипотентные клетки могут дифференцироваться во все типы клеток, кроме клеток внезародышевых органов (плаценты и желточного мешка).
  

• 12 слайд

   Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (induced pluripotent stem cells, iPSC или iPS) удалось получить из клеток различных тканей (в первую очередь фибробластов) с помощью их репрограммирования методами генетической инженерии.
  
  В ранних работах iPS пытались получить путём слияния «взрослых» клеток с ЭСК. В 2006 году были получены iPS из сперматогониев мышей и людей.
   
  В 2006 году были разработаны методы репрограммирования клеток путём введения в них генов, кодирующих транскрипционные факторы, характерные для плюрипотентных клеток, (в первую очередь, генов транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc и Nanog) с помощью лентивирусов и других векторов. Репрограммирование клеток с целью превращения их в iPS было признано журналом Science главным научным прорывом 2008 г
  
  
  

• 13 слайд

  Джон Гёрдон
  Синъя (Шинья) Яманака
  

• 14 слайд

• 15 слайд

  В 2009 году была опубликована работа, в которой с помощью метода тетраплоидной комплементации впервые было показано, что iPS могут давать полноценный организм, в том числе и клетки зародышевого пути. iPS, полученные из фибробластов кожи мышей с помощью трансформации с использованием ретровирусного вектора, в некотором проценте случаев дали здоровых взрослых мышей, которые были способны нормально размножаться. Таким образом, впервые были получены клонированные животные без примеси генетического материала яйцеклеток (при стандартной процедуре клонирования митохондриальная ДНК передается потомству от яйцеклетки реципиента).
  
  В 2012 г за разработку технологии клонирования и генетического репрограммирования Нобелевская премия по физиологии и медицине была вручена Джону Гердону (Англия) и Шинья Яманака (Япония). А в 2014 г проф. М Такахаши и Ш. Яманака впервые произвели трансплантацию пигментного эпителия сетчатки глаза, полученного из iPS клеток пациентке с возрастной дегенерацией сетчатки.
  
  В Японии есть государственная программа, предусматривающая, чтобы в будущем у 100% населения были банки IPS клеток.
  
  

• 16 слайд

  Современные методы получения ИПК
  

• 17 слайд

• 18 слайд

  Интеграционные методы:
  
  Ретровирусные конструкции.
  
  К. Такахаши и C. Яманака, пионеры в области получения иПСК, определили четыре репрограммирующих фактора: Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc. Эти репрограммирующие факторы были доставлены ретровирусным вектором. Недостатками использования ретровирусного вектора являются потенциальная генетическая нестабильность клеток и его низкая внедряемость в неделящиеся клетки, т. е. невозможность его использования для репрограммирования неделящихся или медленно делящихся клеток (например, нейронов)
  (Takahashi, Yamanaka, 2006, Takahashi et al., 2007)
  

• 19 слайд

  Лентивирусные конструкции.
  
  Также для доставки генного материала используются летивирусы, их особенностью является способность заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, что позволяет их использовать при перепрограммировании всех видов соматических клеток (Yu et al., 2007). Кроме того, они обладают большей вместимостью и менее подвержены иммунному ответу.
  

• 20 слайд

  Неинтеграционные методы
  В 2008 г. группа ученых во главе с С. Дунканом получила ИПСК неинтеграционным методом. В качестве вектора для доставки репрограммирующих факторов (Oct4, Sox2, Klf4, и c-Myc) был использован аденовирус.
  

• 21 слайд

  В 2009 г. Н. Фузаки и коллеги получили иПСК, используя вектор на основе вируса Сендай (Fusaki et al., 2009). Вирус Сендай содержит РНК, и, следовательно, не сможет встроиться в геном клетки.
  

• 22 слайд

  Современные альтернативные методы
  Искуственные хромосы.
  
  Обладают большой вместимостью и сохраняются при делении клетки. Экспрессия генов, внедренных с использование искусственных хромосом, гораздо более стабильна и менее зависит от эффекта положения. М. Хирацука и коллеги разработали искусственную хромосому, содержащую ДНК, в которой закодированы 4 репрограммирующих фактора: Klf4, c-Myc, Sox2 и Oct4, а также ген, «выключающий» белок р-53 (Hiratsuka et al., 2011).
  

• 23 слайд

  мРНК. Метод, разработанный Л. Варрен и коллегами, заключается в периодическом введении в культуру соматических клеток синтетической мРНК, кодирующей 5 репрограмирующих факторов (KLF4, c-MYC, OCT4, SOX2, LIN28) (Warren et al., 2010). Основной проблемой использования экзогенной мРНК является слишком быстрая ее деградация и необходимость периодического введения синтетической мРНК, что может привести к повреждению клеток.
  

• 24 слайд

  Использование рекомбинантных репрограммирующих белков
  Доставка белков в клетку может быть осуществлена как инвазивными методами (микроинъекция, электропорация), так и неинвазивным методом (создание рекомбинантного белка, путем присоединения к исходному белку короткого катионного пептида, способного проникать через клеточную мембрану).
  

• 25 слайд

  Использование смесей («коктейлей») низкомолекулярных соединений для получения иПСК
  Надежду на разработку таких методов дает факт существования в цитоплазме яйцеклетки факторов, приводящих к репрограмированию пересаженного ядра. Некоторые низкомолекулярные соединения повышают эффективность репрограммирования, а некоторые из них, либо их комбинации, могут функционально заменить транскрипционные факторы.
  

• 26 слайд

  Потенциал стволовых клеток и ИПК для клеточной терапии
  

• 27 слайд

  Важным преимуществом иПСК перед ЭСК является то, что они могут быть получены из клеток взрослого организма, а не из эмбриона, что, во-первых, решает этическую проблему, а во-вторых, позволит получать «родные» клетки без риска отторжения.
  Но существуют и проблемы, связанные с возможным применением иПСК, и основная из них – потенциальная онкогенность иПСК, так как основные пути, обеспечивающие плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток, частично совпадают с процессами при онкогенезе.
  

• 28 слайд

  Еще одной важной проблемой было использование вирусов в качестве генетических векторов. иПСК, полученные с помощью генетических векторов, могут иметь непредсказуемые генетические дисфункции.