ЗАВИСИМОСТЬ СОДЕРЖАНИЯ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ПОЧВЕ ОТ ТИПА ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

ЗАВИСИМОСТЬ СОДЕРЖАНИЯ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ

БАКТЕРИЙ В ПОЧВЕ ОТ ТИПА ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Автор: Дьяконова Анна Павловна,

МОУ СОШ № 29 Г.о. Подольск, 11 класс

Автор: Костик Константин Александрович

МОУ СОШ № 29 Г.о. Подольск, 11 класс

Руководитель: Баусина Виталия Львовна

учитель биологии МОУ СОШ № 29  Г.о. Подольск

В связи с создавшейся в мире неблагоприятной экологической обстановкой, ученые мирового сообщества проводят мониторинг биогеоценозов и принимают меры по сохранению исчезающих видов животных и растений. Одной из проблем агроэкосистемы Российской Федерации является истощение почв, что приводит к снижению их плодородия. Самый распространенный путь ее решения – внесение минеральных удобрений, однако он приводит к закислению почв и тем самым нарушает экосистему. Другой способ – применение микробиологических удобрений. Однако он имеет ограничения, связанные с кислотностью почв, которые имеют достаточно широкое распространение, в том числе в Московской области. Поэтому в настоящее время остро стоит проблема выделения и разведения бактерий рода Azotobacter, способных жить в кислых почвах для создания бактериальных удобрений.

Актуальность  заключается в выявление  видов бактерий рода Azotobacter, которые могут быть использованы для поддержания плодородия и биологических свойств почв во всем мире. На наличие азотобактеров нами исследована почва, которая была подвергнута разным типам воздействия: интенсивному  - постоянному влиянию абиотического фактора (температура, полив, освещенность, аэрация) в условиях теплицы  и экстенсивному - разовому  изменению биотического фактора (высадка различных видов деревьев и кустарников в целях создания лесопарковой зоны около города).

Объект исследования:   почва  Московской области Г.о. Подольск, находящаяся на территории заказника «Широколиственные леса Подольского лесничества» и в биоэнергетическом комплексе МОУ СОШ № 29. Предмет исследования: Изучение зависимости содержания азотофиксирующих бактерий в почве от типа воздействия и интенсивности ее использования. Цель исследования: Изучить содержание азотофиксирующих бактерий в почве в зависимости от типа ее использования (постоянного интенсивного в результате поддержании параметров микроклимата в условиях теплицы и разового экстенсивного отложенного во времени при смене фитоценоза).

 Задачи исследования: 1. На основании литературных источников изучить строение почвы, биологические особенности бактерий вида Аzotobacter. 2. На территории Г.о Подольск изучить строение  и провести анализ почв различного характера использования и имеющих разный характер растительности. 3. Найти виды Аzotobacter и установить их количество. 4. Выполнить анализ генов фиксации азота путем проведения полимеразной цепной реакцию (ПЦР) в лаборатории проекта «Охотники за микробами». 5. Оценить полученный результат.

Гипотеза: На содержание азотобактеров влияет тип  использования и  интенсивность его воздействия на почву.  Методы исследования: Изучение и анализ соответствующей литературы; наблюдение; анализ данных; лабораторные исследования; обобщение. Новизна исследовательской работы: выделение  видов азотобактеров, устойчивых к кислым почвам на территории Г.о. Подольск Московской области. Практическая значимость работы: Выделение бактерий, которые будут способны жить в почве с низким уровнем рН для  их дальнейшего разведения с целью использования в качестве новых микробиологических удобрений. Также  материалы данного проекта используют  в качестве дополнительных  на уроках биологии    в  9 и 11 –х классах и внеурочной деятельности МОУ СОШ № 29 им. П.И. Забродина.

Материалы и методы исследования

В 2021-2022 учебном году мы подали заявку на участие в краудсорсинговом научном проекте  «Охотники за микробами». Его организаторами являются фонд «Поддержка проектов в области образования»,  Академпарк,  Инфраструктурный центр Health net, Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Медико-биологический союз. Под руководством ученых Новосибирсой лаборатории  в результате работы участники выделяют азотфиксирующие бактерии, которые пополняют коллекцию штаммов азотфиксаторов. Цель - поиск новых штаммов, полезных для научных исследований в Новосибирском Академгородке. Также  образцы пополняют банк почв Российской Федерации. Наше мотивационное письмо заинтересовало организаторов и мы были приглашены к участию.

Наши исследования проведены с сентября 2021 года по февраль 2022 года. Пробы почв взяты на территории г.о. Подольск Московской области. Образцы получены: на территории   школы МОУ СОШ 29 им. П.И Забродина и в  биоэнергетическом  комплексе, который находится на пришкольной территории; в  заказнике  «Широколиственные леса Подольского лесничества» недалеко от ж/д станции Весенняя, где в 100 м друг от друга в свое время были высажены: сосновый бор, дубрава, орешник (т.е. искусственно созданные биогеоценозы). Таким образом, нами исследована почва, подверженная разным типам воздействия: 1. Экстенсивному отложенному во времени  при смене фитоценоза в целях создания лесопарковой зоны около города: почва соснового бора;  почва дубравы; почва орешника (контрольный образец отобран в естественном биоценозе березовом лесу). 2. Интенсивному постоянному в результате поддержания параметров микроклимата (полив, температура, аэрация, освещение) в условиях теплицы (контрольный образец отобран около теплицы). Почва взята методом прикопки (поверхностный разрез глубиной около 40 см). Исследования проведены по алгоритму, описанному в  Методические рекомендациях [5], полученных нами вместе с набором для исследований. Дальнейшее изучение образцов методом секвенирования будет проведено в научно-исследовательском центре. Взяв пробы методом прикопки, мы просушили их и подготовили к дальнейшим исследованиям. Затем определили механический состав почвы  и ее кислотность согласно описанным в Приложении методикам. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Исследование механического состава почвы и кислотности

№	Почва	Механический состав	рН	Кислотность
Опытная группа № 1
1	Орешник	Среднесуглинистый	6	Нейтральная
2	Сосна	Среднесуглинистый	6	Нейтральная
3	Дуб	Тяжелосуглинистый	6	Нейтральная
4	Контроль Береза	Глинистый	6	Нейтральная
Опытная группа № 2
5	Теплица  (внутри)	Среднесуглинистый	6	Нейтральная
6	Контроль Теплица (снаружи)	Среднесуглинистый	6	Нейтральная

Как видно из таблицы, кислотность всех образцов почвы – нейтральная.

Следующим нашим шагом было изучение почвенного дыхания с вычислением массы углекислого газа в каждом образце (График 1). Самое высокое содержание углекислого газа оказалось в почве теплицы. Затем мы изучили содержание карбонатов в почве. Все исследуемые образцы содержали около 1 % карбонатов  (Диаграмма 1).

График 1. Почвенное дыхание	Диаграмма 1. Процент карбонатов в образцах почв

Далее, следуя методическим рекомендациям и инструкциям по применению набора «Охотники за Микробами», мы выполнили посев всех образцов почвы, указанных выше и наблюдали за ростом колоний бактерий рода Azotobacter (фото 1).  В связи с локдауном, первый посев удалось проверить на 18 сутки (фото 2-4). При учете численности микроорганизмов мы посчитали обросшие колониями комочки почвы и, зная общее количество комочков, высчитали процентное содержание обрастаний.  

Наблюдение за ростом колоний бактерий Azotobacter
Фото 1. Посев почвы		Фото  2. Интенсивность обрастания почвы дуба на 18-е сутки	Фото 3. Интенсивность обрастанииобрастания почвы орешника на 18-е сутки	Фото 4. Интенсивность обрастания почвы теплицы (внутри) на 18-е сутки

Проводя микроскопические исследования на разных увеличениях микроскопа, нам  удалось найти Azotobacter в образцах почвы внутри теплицы и около орешника и берёзы (фото 5-8). Наиболее богатые бактериями оказались почва орешника и почва теплицы внутри. Надо отметить, что к 30 дню обрастание было отмечено на всех образцах.

Фото 5. Azotobacter в образцах  почвы внутри теплицы	Фото 6. Azotobacter в образцах  почвы около орешника	Фото 7 . Цисты Azotobacter в образцах  почвы внутри теплицы	Фото 8. Цисты Azotobacter в образцах  почвы около орешника

Проанализировав данные, нам удалось выявить почвы с наименьшими и наибольшими показателями содержания углекислого газа. Интенсивность дыхания почвы оказалась наиболее высокой  в почве теплицы. Это значит, что микроорганизмы наиболее активно разлагают органическое веществ внутри этой почвы. Содержание карбонатов в образцах почв минимальное (1,0%-1,20%), что еще раз доказывает, что почва не подвергалась каким-либо химическим обработкам. [1,7].   На графике 2 представлен процент обрастания азотобактерами образцов почв дуба, орешника и теплицы. 

График 2. Посев и наблюдение за ростом колоний бактерий Azotobacter

Хочется отметить, что спустя две недели почва теплиц стала обрастать намного обильнее и интенсивнее, чем другие.

Проводя микроскопические исследования на разных увеличениях микроскопа, нам  удалось найти Azotobacter в образцах  почвы внутри теплицы и около орешника и берёзы. В теплице доступного органического вещества оказалось значительно больше, чем в лесопарковой зоне. Это связано с тем, что органического вещества в тепличной почве, доступного микроорганизмам,  оказалось существенно выше чем под орешником. Более высокая биологическая активность тепличной почвой коррелировала большим количеством азотобактеров в этой почве.

Выводы. В теплице доступного органического вещества оказалось значительно больше, чем в лесопарковой зоне. Это связано с тем, что органического вещества в тепличной почве, доступного микроорганизмам,   оказалось существенно выше чем под орешником. Более высокая биологическая активность тепличной почвой коррелировала большим количеством азотобактеров в этой почве.

При различном типе использования почвы: интенсивном в условиях биоэнергетического комплекса (теплица), и отсроченном во времени экстенсивном в  лесопосадках  наблюдается разная динамика роста азотфиксирующих бактерий. 

Заключение. Выдвинутая нами гипотеза о том, что «На содержание азотобактеров влияет тип  использования и  интенсивность его воздействия на почву»  находит подтверждение  в наиболее интенсивном обрастании образцов теплицы. 

Основной перспективой нашего проекта является выявление азотофиксирующих бактерий в почве в зависимости от антропогенного влияния на нее. В дальнейшем это может привести к бережному отношению к почве Подольского района, а так же к использованию новых микробиологических удобрений.  Образцы данного проекта пополнили банк почв Российской Федерации. ПЦР выполнена выборочно в лаборатории Новосибирска .

Фото 9. Результат электрофореза (Azotobacter на рН1*)

*Продукт амплификации гена nifH, которыйявляется ферментом нитрогеназы, ожидаем на 400

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1.                  Direct.farm Карбонатные почвы – содержание элементов URL: https://direct.farm/post/karbonatnyye-pochvy--soderzhaniye-elementov-839

2.                  Агроэкосистема. Agroportal URL: Агросистема – природная и искусственная, отличия от экосистемы, особенности (ecoportal.info)

3.                  Википедия. Азотобактер. URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Азотобактер

4.                  Литература для команд. Краудсорсинговый проект «Охотники за микробами» URL: https://drive.google.com/drive/folders/1NRKl-oAOU5zvwhhcq6FN13ooth9qeIqW

5. Методические рекомендации к краудсорсинговому проекту «Охотники за микробами» URL: «https://drive.google.com/file/d/1WjnLU2ymRUYU0wmCUdFmZ5vJ4SihoCh9/view

6. С. Русель. Микроорганизмы и жизнь почвы URL: https://drive.google.com/drive/folders/1NRKl-oAOU5zvwhhcq6FN13ooth9qeIqW

7. Студопедия Методы определения карбонатов щелочно-земельных металлов и гипса в почвах  URL: https://studopedia.ru/3_68904_metodi-opredeleniya-karbonatov-shchelochno-zemelnih-metallov-i-gipsa-v-pochvah.html

8. Экоанализ. Природно-экологическая ситуация Подольского района Московской области URL:  www.ecoanaliz.ru/prirodno-ekologicheskaya-situaciya-podolskogo-rajona-moskovskoj-oblasti/