Научная разработка на тему: "Принципы получения гибридом".

Принципы культивирования миеломных линий:

1.     Миеломная линия, предварительно проверенная на способность к слиянию, должна быть размножена и заморожена в достаточном количестве;

2.     После разморозки клетки можно вести в культуре не более одного месяца;

3.     Для слияния берут миеломные клетки в логарифмической фазе роста, для этого в культуру через день добавляют свежую среду; до момента слияния клетки должны находиться в этой фазе, по крайней мере, одну неделю;

4.     Концентрация клеток в культуре не должна превышать 0,5 – 1,0 млн./мл;

5.     Культуру клеток необходимо ввести в культуральную среду, к которой она адаптирована; перевод культуры в другую среду проводят постепенно;

6.     Периодически целесообразно культивировать миелому в присутствии токсического аналога нуклеотидов, использованного для селекции данной линии, чтобы избежать перерастания ревертантов;

7.     Если миеломная линия потеряла способность к слиянию, размораживают новые ампулы, хранящиеся в жидком азоте.

2.     Иммунизация мышей антигеном.

Схемы иммунизации, применяемые разными исследователями, значительно варьируются и определяются имеющимся типом и количеством антигена. Иммунизация должна стимулировать формирование иммунного ответа и выраженное антителообразование.

Антиген вводят внутривенно, внутрибрюшно или подкожно с адъювантом (веществом, усиливающим иммуногенность антигенов) или без него в нарастающей дозе.

При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные детерминанты всех компонентов вводимого материала. Это осложняет отбор клонов, синтезирующих нужные антитела. Поэтому по возможности для иммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере, на ее последних этапах. Однако одним из основных достоинств гибридомной технологии является именно то обстоятельство, что специфические антитела против данного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочищенный препарат антигена, и затем использовать эти антитела для его очистки

Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться образовывать антителопродуцирующие гибридные клетки. Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимо выделить селезеночные лимфоциты животных через 3 – 4 суток после последней иммунизации, т.е. когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток.

Способы и схемы иммунизации.

Существует большое число способов и схем иммунизации. Схемы иммунизации зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков – слабые иммуногены. В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ животного. Среди адъювантов широкое распространение получил полный адъвант Фрейда (ПАФ). Помимо этого используют введение антигена, преципитированного на квасцах вместе с антигеном убитых клеток Bordetella pertussis. Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для развития иммунного ответа. Вместе с тем гипериммунизация может снизить способность образовывать гибридомы. Хотя иногда бывает достаточно одной иммунизации.