ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЛОКУСОВ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПРИЗНАКОВ УСТОЙЧИВОСТИ ПРОРОСТКОВ К ЛИСТОВОЙ И СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНЕ У МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛНОГЕНОМНОГО АССОЦИАТИВНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Идентификация локусов количественных признаков устойчивости проростков к листовой и стеблевой ржавчине у мягкой пшеницы с использованием полногеномного ассоциативного исследования

Алибек Затыбеков

Юлия Гениевская

Аралбек Рсалиев

В последние годы листовая ржавчина (LR) и стеблевая ржавчина (SR) стали серьезной угрозой для производства мягкой пшеницы в Казахстане. Большинство местных сортов восприимчивы к этой ржавчине, что сказалось на их урожайности и качестве. Создание новых сортов с высокой продуктивностью и устойчивостью к болезням LR и SR, в том числе с использованием маркерной селекции, становится важным приоритетом в местных селекционных проектах. Поэтому поиск ключевых генетических факторов, контролирующих устойчивость на всех стадиях развития растений, включая стадию проростков, имеет большое значение. В этой работе мы применили подход полногеномного исследования ассоциации (GWAS) с использованием 212 местных образцов мягкой пшеницы, которые были фенотипированы на устойчивость к определенным расам Puccinia triticina Eriks. ( Pt ) и Puccinia graminisф. сп. tritici ( Pgt ) на стадии проростков. Коллекцию генотипировали с использованием анализа 20 K Illumina iSelect SNP, и для картирования ассоциации было отобрано 11 150 полиморфных SNP-маркеров. Используя смешанную линейную модель, мы идентифицировали 11 локусов количественных признаков (QTL) для пяти из шести конкретных рас Pt и Pgt .. Сравнение результатов этого GWAS с результатами ранее опубликованной работы показало, что девять из одиннадцати QTL для устойчивости к LR и SR были ранее зарегистрированы в исследовании GWAS на стадиях роста взрослых растений пшеницы. Поэтому предполагалось, что эти девять общих идентифицированных QTL были эффективны для устойчивости на всех стадиях к LR и SR, а два других QTL оказались новыми QTL. Кроме того, было обнаружено, что пять из этих девяти QTL, которые были идентифицированы ранее, связаны с компонентами урожайности, что позволяет предположить, что они могут напрямую влиять на полевые показатели мягкой пшеницы. Идентифицированные QTL, включая новые QTL, обнаруженные в этом исследовании, могут играть важную роль в процессе селекции для повышения устойчивости пшеницы к LR и SR.

Ключевые слова: мягкая пшеница ; листовая ржавчина ; стеблевая ржавчина ; сопротивление ; отображение ассоциации

1. Введение

Мягкая пшеница, или мягкая пшеница ( Triticum aestivum L.), является одной из основных зерновых культур, возделываемых во всем мире, и, таким образом, имеет важное значение для обеспечения продовольственной безопасности. Казахстан входит в десятку крупнейших экспортеров пшеницы с объемом производства 11,4 тыс. тонн в 2019 году[ 1 ]. По данным Бюро национальной статистики Казахстана, посевная площадь под пшеницей в 2021 году составила 12,2 млн га, что составляет около 76,7% от общей площади, используемой под зерновые культуры в стране [ 2 ]. Одной из самых больших проблем в производстве пшеницы во всем мире являются лиственные болезни. Среди грибковых патогенов пшеницы во всем мире Puccinia graminis f. сп. tritici ( Pgt ), вызывающие стеблевую ржавчину (SR), иPuccinia triticina Eriks. ( Pt ), вызывающие бурую ржавчину (ЛР), являются наиболее распространенными [ 3 , 4 , 5 ]. LR и SR могут вызывать более 50% потерь урожая зерна у восприимчивых сортов пшеницы [ 6 ], в то время как некоторые агрессивные штаммы, такие как Pgt race Ug99, вызывают серьезные потери урожая пшеницы до 90% [ 5 , 7 ].

Pt — облигатный биотрофный гриб, поражающий в основном листья на разных стадиях роста, но может также поражать листовые влагалища и колосковые чешуи [ 8 ]. Pt является значительным препятствием для производства пшеницы, обычно вызывая потери урожая от 1% до 20% на большой площади. Однако, если серьезное заболевание возникает до времени колошения, до 90% урожая пшеницы может быть уничтожено [ 9 ]. Возникновение LR в Казахстане наблюдается с тех пор, как пшеницу начали выращивать в более широких масштабах в начале 1900-х годов. Возделывание восприимчивых сортов приводило к эпидемиям ЛР в среднем в 1 год из 4, поражая до 5 млн га с потерями урожая до 25–30% [ 10 , 11 ]. пгтвызывающая SR, является еще одной важной болезнью ржавчины, которая часто считается наиболее разрушительной из болезней пшеницы, потому что она может привести к полной потере урожая на большой площади в течение короткого периода времени [ 7 ]. В 2015 и 2016 гг. в северных регионах Казахстана, а также в соседней Омской области России произошла крупная эпидемия СР, поразившая около 2 млн га пшеницы [ 11 , 12 ]. В 2017–2018 гг. в северных и восточных регионах Казахстана вновь произошла эпидемия СР, которая привела не только к резкому снижению урожайности, но и к снижению качества зерна [ 11 , 12 , 13 , 14 ].]. В течение 2015–2018 гг. заболеваемость и заболеваемость в основных зерносеющих районах Казахстана достигали 90 и 70 % соответственно и были существенно выше, чем в предыдущие годы [ 11 , 15 ].

Одним из наиболее эффективных способов предотвращения эпидемий ржавчины пшеницы является создание сортов с длительной устойчивостью к патогенам. Устойчивость к LR и SR контролируется разнообразной группой генов, обозначенных как Lr и Sr соответственно [ 16 ]. В настоящее время идентифицировано и описано около 80 генов устойчивости к листовой ржавчине ( Lr ) и около 60 генов устойчивости к стеблевой ржавчине ( Sr ) у мягкой пшеницы, твердой пшеницы и диплоидных видов пшеницы [ 16 ]. Гены устойчивости пшеницы к ржавчине относятся к одному из двух классов: гены устойчивости проростков (R) или гены устойчивости взрослых растений (APR), которые активны только на стадии взрослых растений [ 16 , 17 ].]. Гены APR считаются потенциально более долговечными, в то время как R-гены обладают меньшей долговечностью [ 16 , 18 ]. Гены R часто кодируют белки сайта связывания нуклеотидов и распознают специфические эффекторы патогенов [ 16 ]. Из-за их селективной специфичности к эффекторам R-гены обычно называют расоспецифичными генами. Эта специфичность к определенным расам приводит к большей эффективности R-генов. R-гены в основном имеют более сильные эффекты, но, с другой стороны, они теряют свою силу после нескольких лет работы в полевых условиях [ 16 ]. Также часто появляются новые расы вирулентных патогенов, которые преодолевают даже самые сильные гены устойчивости. Например, раса Pgt Ug99 (известная также как TTKSK) нечувствительна к Sr31.ген устойчивости, высокоэффективный почти против всех рас Pgt [ 7 ]. Это означает, что появление новых вирулентных рас патогенов ограничивает долговечность и эффективность генов R и APR. Показано, что структура популяции возбудителя на той или иной территории непостоянна и может меняться от года к году [ 15 , 19 ]. Следовательно, существует постоянная потребность в новых источниках устойчивости в геноме пшеницы, включая гены R и APR.

Расовый состав возбудителя различен в каждом регионе мира и меняется в зависимости от многих факторов, включая климатические условия и человеческий фактор. Многочисленные исследования расового состава Pt и Pgt в разных странах [ 13 , 14 , 15 , 20 , 21 , 22 ] были проведены с целью поиска устойчивых гермоплазм [ 23 , 24 , 25 ] и QTL [ 26 , 27 , 28 ] .

В Казахстане в 2015–2018 гг. в основных районах выращивания пшеницы в стране выявлено и описано 38 рас Pgt [ 15 ] . Среди них наиболее вирулентные расы RFRTF и TKRTF наблюдались в Костанайской и Акмолинской областях и, в то же время, регистрировались в соседней Омской области Российской Федерации [ 14 ]. Было подтверждено, что гены устойчивости к стеблевой ржавчине Sr11 , Sr13 , Sr22 , Sr26 , Sr31 , Sr33 и Sr35 эффективны против всех рас Pgt , обнаруженных в Казахстане. Хотя Ug99 в Казахстане пока не наблюдался [ 15], недавние сообщения указывают на распространение этой расы на Ближнем Востоке и потенциальный сценарий миграции в Среднюю и Южную Азию [ 5 , 29 ]. В Казахстане на основании оценок во всех основных пшеничных регионах страны в 2018 г. выявлено 25 рас Pt . Расы TQTMQ, TQKHT и TRTHT были наиболее распространены и встречались во всех исследованных популяциях [ 30 ].

Ранее QTL для устойчивости проростков пшеницы к трем распространенным расам Pgt (TKRTF, PKCTC и RKRTF) и трем распространенным расам Pt (TQKHT, TRTHT и TQTMQ) в Казахстане были идентифицированы с использованием двухродительского картирования популяции Памяти Азиаевой × Paragon [ 31 ]. Некоторые из этих QTL были связаны с известными генами Lr и Sr , но несколько QTL были новыми и обладали высоким потенциалом размножения. Однако картирование сцепления (LM), использованное в этом исследовании, имеет определенные ограничения, которые объясняются ограниченным уровнем генетического разнообразия, определяемым родословной родительских линий [ 32 ].]. По сравнению с картированием сцепления, подход полногеномного исследования ассоциации (GWAS) использует большие коллекции зародышевой плазмы с высоким генетическим разнообразием. Коллекция пшеницы в этом исследовании ранее использовалась для GWAS-анализа APR на бурую и стеблевую ржавчины в Южном Казахстане [ 33 ]. Следовательно, возникает интересный вопрос: облегчит ли GWAS идентификацию уникальных расово-специфических QTL, не идентифицированных с помощью LM? Кроме того, другой целью исследования является поиск общности/различий в генах APR и R с использованием GWAS для одной и той же изучаемой коллекции яровой пшеницы. Выявление расоспецифичных QTL было бы полезно для будущего пирамидирования генов устойчивости к ржавчине с целью повышения эффективности производства пшеницы и предотвращения эпидемий ржавчины на территории Казахстана.

2. Результаты

2.1. Скрининг типа инфекции рас Pt и Pgt

В целом генотипы исследуемой коллекции были умеренно восприимчивы к трем расам Pt ( рис. 1 ): 55,7% к расе TQTMQ, 56,6% и 59,9% к расам TRTHT и TQKHT соответственно. Чувствительный тип инфекции наблюдался в 8,9%, 10,9% и 12,3% коллекции. Сорта Саратовская 29 (Россия) и Лютесценс 1082 (Казахстан) были чувствительны ко всем трем испытанным расам Pt . Резистентный тип инфекции отмечен у 15 (7,1%) образцов расы TQKHT и у 24 (11,3%) образцов рас TQTMQ и TRTHT. Сорт Lutescens 1193 (Россия) показал полную устойчивость ко всем трем расам Pt .

Рисунок 1. Сводка реакций 212 сортов пшеницы и селекционных линий на расы Puccinia triticina ( a ) и Puccinia graminis f. сп. тритики ( б ). я: иммунитет; Р: стойкий; MR: умеренно устойчивый; РС: умеренно восприимчив; С: восприимчив.

Оценка устойчивости к трем расам Pgt привела к ответам, аналогичным наблюдаемым для рас Pt . Большая часть коллекции была умеренно восприимчива к расам TKRTF (46,7%) и RKRTF (50%) ( рис. 1 ). Что касается расы PKCTC, то большинство генотипов относились к среднерезистентному типу заражения (36,3%, 77 образцов). Шесть сортов выявили иммунитет ко всем трем расам Pgt . Это образцы ИР-38, ИР-53, Е-795 местных пород; Агент и Гэтчер из Америки; и Seri 82 из Австралии. При скрининге устойчивости сеянцев выявлены три местных сорта (Карабалыкская 25, Карабалыкская 92 и Оскемен), которые имели восприимчивый тип инфекции ко всем трем расам Pgt .

Корреляционный анализ Пирсона выявил сильную положительную корреляцию ( p <0,001) типа инфекции среди всех рас Pt и Pgt ( рис. 2 ).

Рисунок 2. Парный корреляционный анализ типов заражения бурой ржавчиной (LR) и стеблевой ржавчиной (SR).

Двусторонний ANOVA выявил сильное значимое влияние ( p < 0,001) двух факторов (генотипа и расы) как по отдельности, так и в совокупности на устойчивость к LR и SR ( таблица 1 ). Наследуемость в широком смысле ( H 2 ) устойчивости к LR была выше, чем устойчивости к SR ( таблица 1 ).

Таблица 1. Анализ ANOVA типа инфекции LR и SR.

Корреляции устойчивости к LR и SR между проростками и взрослыми стадиями [ 33 ] были очень значимыми ( Таблица 2 ). Среднее значение индекса корреляции для рас Pt было выше для APR_LR (0,642), чем для APR_SR (0,458). Точно так же среднее значение индекса корреляции для рас Pgt было выше для APR_SR (0,634), чем для APR_LR (0,468).

Таблица 2. Взаимосвязь между расовидной устойчивостью сеянцев и устойчивостью взрослых растений (APR) к листовой ржавчине (LR) и стеблевой ржавчине (SR) в исследуемой коллекции.

2.2. Результаты генотипирования и анализ структуры популяции

Генотипические данные 212 образцов мягкой пшеницы были собраны по 11 510 полиморфным SNP-маркерам, отобранным для GWAS. Распределение маркеров SNP среди геномов составило 2186 для A, 2955 для B и 414 для D. Остальные 5955 маркеров в массиве 20K имели неизвестные геномные позиции. Хромосома 2В имела наибольшее количество маркеров (640 SNP), а хромосома 7А была самой длинной хромосомой (216,0 сМ). Средняя плотность SNP для трех геномов составила 1,6 маркера/см3. Наибольшая плотность наблюдалась для генома В со средним расстоянием 0,3 сМ между соседними маркерами. В целом плотность генома D была примерно в семь раз меньше плотности геномов A и B [ 33 ].]. В среднем неравновесие по сцеплению (LD) уменьшалось при 14,9 сМ для всего генома при R2, равном 0,1. Для субгеномов LD снижается при 7,1 и 5,3 сМ в геномах A и B соответственно; для генома D LD достигает 19,2 сМ [ 33 ]. На основании результатов анализов STRUCTURE и STRUCTURE Harvester матрица Q была разработана для трех субпопуляций, как это было предложено Genievskaya et al. [ 33 ]. Сгенерированная матрица Q использовалась в качестве ковариационной матрицы для MLM + Q + K в TASSEL.

2.3. Отображение ассоциации

Всего для расоспецифичной устойчивости проростков к LR и SR было выявлено 11 ассоциаций маркер-признак со значительными значениями p . Выявленные ассоциации маркер-признак располагались на восьми хромосомах (1А, 1В, 1D, 2А, 4В, 5В, 6А и 7А). Графики Manhattan и QQ для всех гонок представлены в Таблице S1 . Физические положения, эффекты и значения R2 для идентифицированных SNP, связанных с расоспецифичной устойчивостью проростков к LR и SR, приведены в таблице 3 . Все ассоциации маркер-признак были обозначены как QTL и расположены на генетической карте вместе с приблизительными позициями потенциальных генов-кандидатов на устойчивость к LR и SR ( таблица 3 и таблица S2 ; рисунок S1 ).). Среди идентифицированных QTL три имели ассоциации с устойчивостью только к LR. Остальные восемь идентифицированных QTL были связаны с устойчивостью к обоим заболеваниям (LR и SR).

Таблица 3. Перечень локусов количественных признаков (QTL) расоспецифичной устойчивости проростков к листовой ржавчине (LR) и стеблевой ржавчине (SR).

Все одиннадцать QTL, ответственных за устойчивость к LR, были связаны с расой TRTHT. Один из QTL был связан с комбинацией рас TQKHT и TRTHT, а шесть QTL — с комбинацией всех трех рас ( таблица 3 ). Восемь из одиннадцати LR QTL были связаны с расой Pgt TKRTF, а две — с комбинацией рас TKRTF и RKRTF ( таблица 3 ). Ни один из QTL не был связан с PKCTC ( таблица 3 ). Примечательно, что не было генетических факторов, общих для этой работы и отчета, основанного на изучении одних и тех же рас Pt и Pgt с использованием двухродительского картирования популяции Pamyati Azieva × Paragon [ 31 ].

QTL, выявленные в этом исследовании, были проанализированы и сопоставлены с QTL, о которых ранее сообщалось, для устойчивости к APR к LR и SR, которые были идентифицированы с использованием данных GWAS из RIBSP 2018–2019 [ 33 ], и QTL, о которых ранее сообщалось, что они связаны с выявленными признаками, связанными с урожайностью. с использованием данных GWAS из северного Казахстана за 2018–2020 гг. [ 34 ] ( табл. 4 ). Кроме того, расположение каждого идентифицированного QTL сравнивали с генетическими положениями известных генов Lr и Sr ( таблица 4 ). Всего три кандидата Lrгенов и 9 QTL были обнаружены для 11 QTL, связанных с устойчивостью к LR в этом исследовании. При анализе QTL устойчивости к SR не было обнаружено сходства между генетическими местоположениями известных генов Sr и было одно сходство с ранее идентифицированными QTL ( таблица 4 ).

Таблица 4. Сравнение локусов количественных признаков (QTL) устойчивости проростков к листовой ржавчине (LR) и стеблевой ржавчине (SR), выявленных в этом исследовании, с ранее описанными QTL и генами -кандидатами Lr и Sr.

3. Обсуждение

Результаты указывают на отсутствие QTL, идентифицированных как на стадии проростков в этом исследовании GWAS, так и в предыдущем исследовании LM с использованием RIL Памяти Азиевой × Paragon [ 31 ], что предполагает разные ответы между двумя типами генетического материала с одними и теми же расами Pt и Pgt . Примечательно, что как APR для LR, так и SR в популяциях LM и GWAS были протестированы в одной и той же среде и в одни и те же годы (RIBSP, 2018–2019). Можно предположить, что различие, вероятно, определялось специфичностью реакции популяции LM из-за родословной, ограниченной двумя родительскими пулами. Кроме того, в отличие от исследования LM [ 31] где не было зарегистрировано корреляции между расоспецифической устойчивостью проростков и APR, корреляция устойчивости между двумя стадиями роста в этом исследовании оказалась высоко значимой ( p < 0,0001).

Напротив, было обнаружено, что 9 из 11 QTL, идентифицированных в этом исследовании, были ранее идентифицированы в APR GWAS с использованием данных RIBSP в 2018–2019 гг. [ 33 ] ( таблица 4 ), что позволяет предположить, что это QTL для всех стадий устойчивости. . Примечательно, что все девять QTL в этой сравнительной оценке характеризовались схожими направлениями эффектов QTL, т.е. либо в сторону устойчивости, либо в сторону восприимчивости. Кроме того, ранее было обнаружено, что пять из этих девяти QTL связаны с компонентами урожайности [ 34 ] ( Таблица 4 ), что позволяет предположить, что эти QTL могут напрямую влиять на полевые показатели мягкой пшеницы. Сравнительная оценка всех одиннадцати идентифицированных QTL позволяет предположить, что два QTL ( QLr.ipbb-1A.3 иQLr.ipbb-1B.5 ) предположительно были новыми, поскольку о них не сообщалось в ранее опубликованных исследованиях LR и SR ( таблица 4 ).

Большинство изученной коллекции показали умеренно восприимчив ИТ на стадии рассады всех рас Pt и ПГТ , за исключением PGT расы PKCTC, где большинство присоединений были умеренно устойчивы ( рисунок 1 ). Дисперсионный анализ показал более значимое влияние генотипа пшеницы по сравнению с расовым типом на устойчивость к обоим заболеваниям ( табл. 1 ), что свидетельствует о значительном участии генетических факторов в устойчивости ко всем шести изученным расам.

3.1. Модели идентифицированных QTL для устойчивости к листовой и стеблевой ржавчине

Множественные появления большинства QTL были связаны с устойчивостью к LR на разных стадиях роста и в разных средах. В частности, шесть идентифицированных QTL оказались эффективными в отношении устойчивости к LR ко всем трем конкретным расам, что указывает на широкую стабильность этих локусов. Три из этих шести QTL ( QLr.ipbb-2A.2 , QLr.ipbb-4B.2 и QLr.ipbb-6A.2 ) показали эффекты в отношении устойчивости к LR, в то время как эффекты в остальных трех QTL ( QLr.ipbb- 1B.2 , QLr.ipbb-6A.6 и QLr.ipbb-7A.2 ) были в сторону чувствительности ( таблица 3 ). Последние три QTL могут быть выбраны для быстрого устранения восприимчивых сортов путем селекции. Интересно,QLr.ipbb-4B.2 располагался вблизи генов Lr12 (70,9 сМ) [ 35 ], Lr31 (70,9 сМ) [ 36 ] и Lr49 (81,5 сМ) [ 37 ] на хромосоме 4В ( таблица 5 ). Этот результат подтверждает ранее сообщавшиеся эффекты Lr12 [ 35 ] в северном и юго-восточном Казахстане [ 11 ]. QLr.ipbb-6A.2 был точно картирован с SNP-маркером S16_50275005 LR, идентифицированным Juliana et al. [ 38 ], который находится рядом с Traes_6AS_EB7270F83ген с предсказанной функцией LRR (лейцин-богатые повторы), подобной рецептору STPK (серин/треонин-протеинкиназа). QTL QLr.ipbb -1B.5 , QLr.ipbb-2A.2 и QLr.ipbb-4B.2 расположены в том же положении, что и QTL 1B_1, 2A_2 и 4B_3 , идентифицированные в GWAS для LR Gao et al. . [ 39 ]. Кроме того, QLr.ipbb-7A.2 находился рядом с QTL 7A_3 (~2 сМ) [ 39 ]. QTL QLr.ipbb-2A.2 располагался примерно в 1,4 сМ от SNP IWA574, который, как ранее было установлено, связан с устойчивостью проростков к расе Pt TBDJ [ 40 ]. QLr.ipbb -5B.1находился в генетической позиции, сходной с QLr.fcu-5BL, связанной с устойчивостью к LR-полю [ 26 ].

Таблица 5. Характер вирулентности/авирулентности рас патогенов, используемых в исследовании, основанный на номенклатуре Лонга и Колмера [ 41 ] для LR и Рельфса и Мартенса [ 42 ] для SR.

Ни один из восьми SR QTL, идентифицированных в этом исследовании ( Таблица 4 ), не был расположен вблизи известных генов Sr. Кроме того, все восемь QTL SR на стадии проростков придают устойчивость проростков к LR и устойчивость взрослых особей к SR, подтверждая, что идентифицированные QTL экспрессируются как на стадиях проростков, так и у взрослых. Сравнительная оценка идентифицированных QTL SR в этом исследовании с известными факторами устойчивости к SR также выявила несколько примеров плейотропных эффектов. Например, расположение QSr.ipbb-1B.2 (раса TKRTF) было рядом с генетическим положением IWB42604, что было связано с устойчивостью проростков к расе TRTTF [ 43 ]. Два QTL, ответственных за устойчивость к SR, были ранее идентифицированы Genievskaya et al. [33 ] на стадии взрослого растения ( табл. 4 ). Обзор связанной литературы, включающий множество исследований мягкой и твердой пшеницы и их устойчивости к LR и SR, позволяет предположить, что плейотропия является распространенным сценарием [ 44 , 45 ]. Следовательно, результаты этого исследования могут положительно повлиять на развитие высокоурожайной зародышевой плазмы пшеницы с устойчивостью к расам Pt и Pgt посредством применения селекции с помощью маркеров.

3.2. Сравнение физического положения SNP в локусах количественных признаков и белок-кодирующих генах

Среди одиннадцати ассоциаций маркер-признак, выявленных в этой работе ( Таблица 4 ), три гена, кодирующие белок, потенциально непосредственно вовлечены в детерминацию устойчивости к возбудителям ржавчины. Положение одного из этих генов, TraesCS4B02G328500 , кодирующего белок, содержащий домен главного облегчающего суперсемейства (MFS), перекрывалось с положениями QLr.ipbb-4B.2 и QSr.ipbb-4B.1 . Ранее сообщалось, что переносчик MFS участвует в секреции грибкового токсина, который поражает виды-хозяева [ 46 ]. Положение гена TraesCS7A02G250500 , кодирующего L-аскорбатпероксидазу 6, перекрывается с позициями QLr.ipbb-7A.2 и QSr.ipbb-7A.2.. Гоу и соавторы (2015) предположили, что фосфорилирование аскорбатпероксидазы геном киназы пшеницы START 1 ( WKS1.1 ) снижает способность клеток детоксицировать активные формы кислорода, тем самым способствуя гибели клеток [ 47 ]. Этот ответ занимает на несколько дней больше времени, чем типичные реакции гибели гиперчувствительных клеток, что позволяет ограничить рост патогенов и ограниченное спорообразование, что характерно для реакции частичной резистентности WKS1 к Puccinia striiformis [ 47 ]. Положение другого гена, TraesCS7A02G389100 , кодирующего белок, содержащий домен Rab-GAP TBC, физически перекрывается с генетическими позициямиQLr.ipbb-7A.2 и QSr.ipbb-7A.3 . Этот белок оказывает положительное или отрицательное влияние на иммунный ответ пшеницы на заражение возбудителями ржавчины в зависимости от его уровня [ 48 ]. Хотя функции белок-кодирующих генов, ассоциированных с SNP, как указывалось выше, прямо не объясняют генетический механизм устойчивости к изучаемым ржавчинам, они все же указывают на их потенциальное участие в сложных процессах устойчивости растений.

4. Материалы и методы

4.1. Генетический материал

Всего было отобрано 212 ( Таблица S3 ) сортов пшеницы и селекционных линий, которые были оценены на предмет их реакции на воздействие рас Pt и Pgt на стадии проростков. В коллекцию вошли 88 товарных и перспективных селекционных сортов Казахстана и России, в том числе 64 сорта, допущенных к использованию на территории Казахстана Государственной комиссией по семеноведению; 38 сортов из Европы предоставлены Центром Джона Иннеса, Великобритания; 86 сортов и линий из Казахстана, России, США, Канады, Мексики, Германии и Австралии, предоставленных НИИ проблем биологической безопасности (НИИББ, Гвардейский, ЮКО) [ 33]. Большинство сортов и линий из Казахстана и России произошли от местного скрещивания, хотя некоторые произошли от программы челночного разведения Казахстанско-Сибирской сети по улучшению яровой пшеницы.

4.2. Оценка LR и SR сеянцев

Оценку расоспецифической устойчивости проводили на стадии рассады в условиях теплицы в НИИБЗ в 2019 г. Для оценки устойчивости сеянцы изучаемой коллекции инокулировали отдельно тремя расами P. triticina (TQTMQ, TQKHT и TTHT). и три расы P. graminis (TKRTF, PKCTC и RKRTF) с разным уровнем вирулентности к генам Lr и Sr соответственно [ 15 , 30 ].]. Семена каждого образца высевали в пластиковые горшки (по 6 семян в горшок) в двух повторностях для каждой расы ржавчины. Перед инокуляцией урединиоспоры рас патогенов (хранили в холодильнике при -80 °С) прогревали при 40 °С в течение 10 мин с последующим замачиванием во влажной камере при 20 °С в течение 2 ч, содержащей 23,5% раствор КОН. (относительная влажность 80 %) [ 49 ]. Затем урединиоспоры суспендировали в легком минеральном масле (Soltrol 170) и каждый горшок с проростками пшеницы индивидуально инокулировали опрыскиванием расами Pt и Pgt .на полностью распустившиеся первичные листья 7–9-дневных проростков. Проростки инкубировали во влажной камере в темноте при температуре 18 ± 2 °С и влажности 100 % в течение 14 ч, а затем подвергали воздействию люминесцентного света в течение 3–4 ч. Инокулированные растения помещали в тепличные ящики, с благоприятными условиями (22 ± 2 °С для стеблевой ржавчины, 18 ± 2 °С для бурой ржавчины) и освещенностью (10–15 тыс. лк, световой период 16 ч) [ 26 , 50 , 51 ]. Устойчивость исследуемой коллекции оценивали через две недели после инокуляции по методике Stakman et al. шкала типа инфекции [ 52]. Значения типа заражения для каждой комбинации образца пшеницы и расы патогена определяли как среднее значение для 6 растений в горшке. Чтобы использовать Stakman et al. шкале GWAS шкала 0–4 была преобразована в линейную шкалу 0–9, как это было предложено Zhang et al. [ 53 ]. Средние значения устойчивости для двух повторностей далее использовали в GWAS.

Статистический анализ включал корреляционный анализ и дисперсионный анализ (двусторонний дисперсионный анализ) с использованием SPSS 22.0 ( https://www.ibm.com/support/pages/spss-statistics-220-available-download , по состоянию на 13 июля 2021 г. ). ) и STATISTICA 10.0 ( http://statsoft.ru/resources/support/download.php , по состоянию на 21 июля 2021 г.). Компоненты дисперсии (%) определяли путем деления фенотипической дисперсии, обусловленной каждым компонентом, на общую фенотипическую дисперсию. Наследуемость в широком смысле ( H 2 ), описывающая долю фенотипической изменчивости, обусловленную генетическими факторами, рассчитывали по следующей формуле:

ЧАС2знак равноо2го2п

где о2г фенотипическая изменчивость, объясняемая генотипом и о2ппредставляет собой общую фенотипическую дисперсию (сумма генотипической дисперсии, расовой дисперсии, генотипа × расовой дисперсии и остаточной дисперсии) [ 41 ].

4.3. Извлечение ДНК и генотипирование

Тотальную ДНК выделяли из проростков образцов пшеницы по Dellaporta et al. [ 42 ]. Концентрацию ДНК для каждого образца доводили до 50 нг/мл. Панели изучаемой коллекции генотипировали с помощью 20K Illumina iSelect SNP assay в компании TraitGenetics GmbH (Гатерслебен, Германия). Генотипирование SNP проводили с использованием программного обеспечения Illumina Genome Studio версии V2011.1 (Illumina Inc., Сан-Диего, Калифорния, США, 2018 г.). Всего было отобрано 11 510 SNP-маркеров [ 33 ] после удаления всех мономорфных маркеров и маркеров с частотой минорного аллеля (MAF) <0,05. Образцы с более чем 10% отсутствующими данными также были удалены.

4.4. Отображение ассоциации

Анализ структуры населения был проведен с использованием программного обеспечения STRUCTURE (v2.3.4.) с подходом Монте-Карло с байесовской цепью Маркова (MCMC) на основе моделей примеси и коррелированной частоты [ 54 ]. Количество гипотетических групп в диапазоне от K = 1 до K = 10 оценивалось с использованием 50 000 итераций приработки, за которыми следовали 100 000 зарегистрированных итераций. Выходные данные STRUCTURE были проанализированы на значение дельта K (ΔK ) в STRUCTURE HARVESTER [ 55 ].

Используя значения K = 5, была разработана Q-матрица для пяти идентифицированных кластеров. GWAS проводили с использованием TASSEL 5.0 (v20191212) [ 56 ] на основе смешанной линейной модели (MLM) с матрицами родства (K) и Q (MLM + K + Q) [ 57 ]. Для подтверждения поправки за счет матриц K и Q были проанализированы линии распределения на каждом графике квантиль-квантиль. Значимые ассоциации маркер-признак были выбраны после применения порога при p <0,0001. Положения и последовательности маркеров SNP были получены из карты 90K Array Consensus генома мягкой пшеницы [ 58 ]. Для маркеров с неизвестными позициями на карте 90K Array Consensus карта CSS POPSEQ 2014 [ 59], доступный в Triticeae Toolbox (2020). Для нескольких значимых ассоциаций маркер-признак, связанных друг с другом, был выбран SNP с наименьшим p -значением. Для поиска кодирующих белок генов, которые перекрываются с выявленными значимыми ассоциациями маркер-признак, последовательность каждого маркера была вставлена ​​в инструмент BLAST [ 60 ] Ensembl Plants [ 61 ] и сопоставлена ​​с эталонным геномом T. aestivum . Генетическая карта была построена с использованием программы MapChart v.2.3 [ 62 ].

5. Выводы

GWAS 212 образцов мягкой пшеницы, инокулированных тремя расами P. triticina (TQTMQ, TQKHT и TTHT) и тремя расами P. graminis(TKRTF, PKCTC и RKRTF) на стадии роста проростков привели к идентификации одиннадцати ассоциаций маркер-признак устойчивости к LR и SR. Девять из одиннадцати идентифицированных QTL были ранее зарегистрированы в GWAS с использованием той же коллекции с оценкой на стадии взрослых растений в естественном инфекционном поле Южного Казахстана в 2018–2019 гг. Соответственно, был сделан вывод, что эти девять идентифицированных QTL были эффективны для устойчивости на всех стадиях к LR и SR, а два других QTL оказались новыми и были эффективны на стадии роста проростков для устойчивости к LR. Ранее было обнаружено, что пять из этих девяти QTL связаны с компонентами урожайности, что позволяет предположить, что эти QTL могут напрямую влиять на полевые показатели мягкой пшеницы. Кроме того, сопоставление SNP в QTL с данными секвенирования физической карты гексаплоидной пшеницы с использованием платформы Ensemble предполагает прямое участие как минимум трех генов, кодирующих белок, в определении устойчивости к возбудителям ржавчины. Полученные результаты могут быть дополнительно подтверждены и потенциально использованы в маркерной селекции для создания новых высокопродуктивных сортов, устойчивых к LR и SR.