VIN3-ПОДОБНЫЙ БЕЛОК OSVIL1 УЧАСТВУЕТ В УРОЖАЙНОСТИ ЗЕРНА И БИОМАССЕ РИСА

VIN3-подобный белок OsVIL1 участвует в урожайности зерна и биомассе риса

Джинми Юн

Хи-Джун Чжон

Гибом Пэк

При ремоделировании хроматина посттрансляционная модификация гистоновых белков опосредуется мультимерными белковыми комплексами. VERNALIZATION INSENSITIVE3 (VIN3) образует комплекс с Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), который опосредует триметилирование H3K27 для подавления экспрессии гена-мишени. У риса четыре гена (OsVIL1-OsVIL4), кодирующие VIN3-подобные белки, повсеместно экспрессируются в различных тканях. Нулевые мутанты osvil2 демонстрируют плейотропные фенотипы, такие как измененное время цветения, дефекты цветочных органов и уменьшенный размер побегов. Напротив, мутанты osvil1 не проявляли значительных фенотипов, за исключением оплодотворения, по сравнению с диким типом. Однако трансгенные растения со сверхэкспрессией OsVIL1показали фенотипы повышенной биомассы и урожайности зерна. Поперечные срезы базальной области удлиняющихся стеблей показали, что увеличение биомассы было опосредовано индуцированием пролиферации клеток в меристеме. Анализ иммунопреципитации хроматина показал, что OsVIL1 подавляет экспрессию гена цитокининоксидазы/дегидрогеназы ( OsCKX2 ) путем связывания с промоторной и генной областями OsCKX2 . Мы также наблюдали, что OsVIL1 модифицировал уровни H3K27me3 в хроматине OsCKX2 . Поскольку OsCKX2 кодирует фермент, расщепляющий активный цитокинин, мы пришли к выводу, что OsVIL1 функционирует в регуляции уровней эндогенного активного цитокинина, тем самым увеличивая высоту и продуктивность растений.

Ключевые слова: рис ; урожайность зерна ; биомасса ; модификация гистонов ; ОсВИЛ1 ; OsCKX2

1. Введение

Рис является основным продуктом питания, и повышение урожайности этой культуры является важной сельскохозяйственной задачей. С этой целью было проведено много исследований по увеличению урожайности рисового зерна. У риса архитектура растений является важным фактором, определяющим продуктивность, которая, как хорошо известно, зависит от активности меристемы [ 1 , 2 ]. Цитокинины играют важную роль в регуляции активности и поддержания меристемы путем увеличения клеточного деления [ 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ]. LONELY GUY ( LOG ) кодирует цитокининрибозид-5'-монофосфатфосфорибогидролазу, которая функционирует на заключительном этапе биоактивного синтеза цитокинина [ 3 ].]. Мутанты LOG демонстрируют дефектное сохранение меристем побегов и серьезное уменьшение размера метелок [ 3 ]. Наиболее эффективный QTL для повышения урожайности зерна, GRAIN NUMBER 1a ( Gn1a ), кодирует цитокининоксидазу/дегидрогеназу (OsCKX2), которая расщепляет активный цитокинин [ 6 ]. Снижение экспрессии OsCKX2 вызывает накопление цитокинина в меристемах соцветий и приводит к большому количеству побегов и колосков на растение [ 6 , 7 ]. Ряд факторов, влияющих на продуктивность зерна и биомассу, связаны с регуляцией OsCKX2 [ 6 , 7 , 8 ].]. Фактор транскрипции цинковых пальцев ЗАСУХОУСТОЙЧИВОСТЬ И СОЛЕТОЛЕРАНТНОСТЬ (DST) непосредственно активирует экспрессию OsCKX2 в меристеме [ 9 ]. Мутантный аллель DST reg1 вызывает подавление OsCKX2 , увеличивая тем самым накопление цитокинина в меристеме соцветия и увеличивая количество ветвей и зерен [ 9 ]. Кроме того, LORGER PANICLE ( LP ), который кодирует белок F-box, содержащий повтор Келха, улучшает архитектуру метелки и урожайность зерна риса [ 10 ]. LP представляет собой белок, локализованный в ER, и взаимодействует с SKP-подобными белками риса, что позволяет предположить, что LP может быть вовлечен в деградацию белка, связанную с ER. Мутация LPген снижает экспрессию OsCKX2 в молодых метелках, вызывая накопление цитокинина. Кроме того, OsVIL2 репрессирует экспрессию OsCKX2 путем прямого взаимодействия с промоторной областью OsCKX2 [ 7 ]. Кроме того, фактор взаимодействия с хроматином OsVIL2 увеличивает развитие метелок и биомассу за счет повышения уровня активного цитокинина.

Репрессивные комплексы Polycomb содержат два основных белковых комплекса, PRC1 и PRC2, в растениях [ 11 , 12 ]. PRC2 представляют собой метилтрансферазы, которые вводят триметилирование лизина 27 на гистоне H3 (H3K27me3) для репрессии нижестоящих генов-мишеней [ 13 , 14 ]. У арабидопсиса комплекс VERNALIZATION 2 (VRN2)-PRC2 состоит из нескольких компонентов: VRN2, SWINGER (гомолог E(Z)гистон-метилтрансферазы), НЕЗАВИСИМЫЙ ОТ УДОБРЕНИЯ ЭНДОСПЕРМ (гомолог ESC) и Musashi-1 (гомолог p55), которые образуют каноническую часть, в то время как три растительно-специфических белка-пальца PHD (растительный гомеодомен) (VRN5, VERNALIZATION INSENSITIVE3 и VEL1) создают дополнительную часть [ 13 , 15 , 16 ].]. Предыдущие сообщения показали, что VRN2-PRC2 играет важную роль в пути яровизации, опосредуя накопление H3K27me3 в локусе FLOWERING LOCUS C ( FLC ) после яровизации [ 13 , 17 , 18 ]. Комплекс VRN2 функционирует на пути яровизации, ассоциированном с VIN3, VIL1/VRN5 и VIL2/VERNALIZATION-LIKE 1 [ 15 , 19 ].]. VIN3 и VIN3-подобные белки состоят из консервативных доменов пальца PHD, домена фибронектина типа III (FNIII) и взаимодействующего домена VIN3 (VID). Палец PHD распознает и связывается с гистоновыми белками, домен FNIII участвует в белок-белковых взаимодействиях, а домен VID отвечает за взаимодействия между другими белками VIL [ 7 , 20 , 21 ].

Хотя реакция яровизации не участвует в контроле времени цветения риса, она связана с четырьмя VIN3-подобными белками: Oryza sativa VIN3-подобными 1-4 ( OsVIL1-4 ) [ 7 , 22 ]. OsVIL2 связывается с O. sativa EMBRYONIC FLOWER 2b (OsEMF2b), компонентом PRC2, и комплекс PHD-PRC2 индуцирует цветение путем подавления O. sativa LEAFY COTYLEDON 2 и FUSCA 3-LIKE 1 ( OsLFL1 ) [ 23 ]. Более того, OsVIL1 связывается с OsEMF2b и индуцирует цветение, подавляя OsLF в условиях короткого дня, но задерживает цветение, индуцируя количество зерен, высоту растений и дату колошения 7 ( Ghd7).) экспрессия в условиях длинного дня [ 24 , 25 ]. OsVIL2 также играет существенную роль в регуляции активности меристем и влияет на биомассу, урожай зерна, рост побегов и развитие колосков [ 7 , 26 , 27 ]. Хотя считается, что и OsVIL1, и OsVIL2 контролируют время цветения, то, как OsVIL1 влияет на другие процессы развития, до сих пор не изучено. Здесь мы сосредоточились на том, чем функции OsVIL1 отличаются от функций OsVIL2, которые уже были изучены. Мы показали, что OsVIL1 увеличивает урожай зерна и биомассу за счет прямой регуляции экспрессии OsCKX2 , аналогично OsVIL2.

2. Результаты

2.1. Мутация OsVIL1 не дает явных фенотипов в развитии колосков и росте побегов

Геном риса содержит четыре VIN3-подобных гена: OsVIL1 , OsVIL2 , OsVIL3 и OsVIL4 ( рис . 1А ). Интересно, что гены OsVIL широко распространены у высших растений, включая ликофиты, голосеменные, амбореллалы, эвдикоты и однодольные, что указывает на их функциональную важность для этих растений ( рис . 1А ). Подобно VIN3-подобным белкам арабидопсиса, белки OsVIL1-4 содержат домены PHD, FNIII и VID ( рис . 1В ). Экспрессия четырех генов OsVIL была широко обнаружена в различных тканях риса ( рис . 1C – F и дополнительный рисунок S1 ).

Рисунок 1. Сравнительный анализ генов OsVIL. ( A ) Филогенетический анализ белков OsVIL1–4 в рисе, арабидопсисе, кукурузе, Sorghum bicolor и Glycine max . ( B ) Белковые структуры OsVIL1–4. ( C – F ) Уровни экспрессии OsVIL1 ( C ), OsVIL2 ( D ), OsVIL3 ( E ) и OsVIL4 ( F ) в различных тканях. Rice Actin1 использовали в качестве внутреннего контроля. Планки погрешностей указывают стандартные отклонения, n = 4.

Чтобы изучить функции OsVIL1, мы создали нулевые мутанты osvil1 , используя метод CRISPR/Cas9. В поколении T 2 мы обнаружили три независимые линии, содержащие вставку из 1 п.н., которая вызывает раннее прекращение трансляции ( рис . 2А). По сравнению с диким типом (WT), высота растений и рост побегов у этих мутантов osvil1 не отличались ( рис . 2В ). Развитие метелок и колосков у мутантов также было нормальным ( рис. 2 C–F). Хотя не было значительных дефектов в развитии цветочных органов, фертильность у мутантов была немного снижена по сравнению с WT ( рис . 2G). Эти результаты показали, что OsVIL1функционирует избыточно с OsVIL2 в большинстве процессов развития, за исключением снижения оплодотворения.

Рисунок 2. Фенотипы дикого типа (WT) и нулевых мутантов osvil1 . ( A ) Схематическая структура OsVIL1 и события мутации, полученные с использованием метода CRISPR/Cas9. В структуре гена черные прямоугольники обозначают четыре экзона, а серые прямоугольники обозначают области 5'UTR и 3'UTR. Стрелкой указаны сайты мутаций, выявленные с помощью метода CRISPR/Cas9. Последовательность-мишень подчеркнута мотивом, примыкающим к протоспейсеру, выделенным жирным шрифтом. Измененные последовательности ДНК обозначены красным цветом. ( Б ) Фенотип роста растений у мутантов WT и osvil1 на стадии созревания семян в условиях рисового поля. ( C ) Фенотипы метелки. Бар = 2 см. ( Д) Фенотипы семян. Бар = 1 мм. ( E ) Общее количество колосков на одной метелке. ( F ) Количество первичных ветвей на основной метелке. ( G ) Плодовитость семян. Планки погрешностей указывают стандартные отклонения, n = статистическая значимость обозначена *** ( p <0,001).

2.2. Сверхэкспрессия OsVIL1 вызывает увеличение урожайности зерна и биомассы

Чтобы определить функцию других VIN3-подобных белков риса, мы создали трансгенные растения OsVIL1 OX ( рис . 3А ). В условиях естественного рисового поля растения OsVIL1 OX продемонстрировали увеличение высоты более чем на 20% по сравнению с сегрегированным WT ( рис . 3B ). Когда была измерена длина каждого междоузлия растений WT и OsVIL1 OX, мы обнаружили, что длина каждого междоузлия была увеличена у растений OX по сравнению с растениями WT ( рис . 3C). Кроме того, у растений ОХ наблюдались еще два удлиненных междоузлия, что указывает на то, что увеличение высоты растений у трансгенных растений было связано с увеличением числа и длины междоузлий ( рис. 3 ).С). Поперечный разрез стеблей показал, что диаметр основных стеблей был увеличен у растений OsVIL1 OX по сравнению с WT ( рис. 3 D-F).

Рисунок 3. Развитие междоузлий трансгенных растений дикого типа (WT) и сверхэкспрессии OsVIL1 (OX). ( A ) Фенотипы примерно через 152 дня после посева (DAS) на рисовом поле. Бар = 10 см. ( B ) Высота растений около 152 DAS. ( C ) Сравнение длины каждого междоузлия примерно на 152 DAS. ( D , E ) Поперечные срезы основного стебля от первого междоузлия трансгенной линии WT и OsVIL1 OX # 1 примерно в 112 DAS. Прутки = 1 мм. ( F ) Сравнение диаметров междоузлий примерно на 112 DAS. Столбики погрешностей указывают на стандартные отклонения, n = 4 или статистическую значимость обозначают *** ( p < 0,001).

Подобно растениям OsVIL2 OX, которые демонстрируют повышенную урожайность зерна, растения OsVIL1 OX продемонстрировали повышенную урожайность зерна ( рис. 4 ). Линии OsVIL1 OX имели более крупные метелки ( рис. 4 A, B) и большее количество первичных ( рис. 4 C) и вторичных ветвей ( рис. 4 D) по сравнению с WT. Увеличение количества первичных и вторичных ветвей вызвало увеличение общего количества колосков на основную метелку ( рис. 4 Д).

Рисунок 4. Развитие метелок у растений дикого типа (WT) и растений со сверхэкспрессией OsVIL1 (OX). ( A ) Фенотип метелки трансгенных линий WT и OsVIL1 OX. Бар = 5 см. ( B ) Длина основной метелки. ( C ) Количество первичных ветвей на главной метелке. ( D ) Количество вторичных ветвей на основной метелке. ( E ) Общее количество колосков на основной метелке. Планки погрешностей указывают стандартные отклонения, n = статистическая значимость обозначена *** ( p <0,001), ** ( p <0,05).

2.3. Сверхэкспрессия OsVIL1 влияет на количество клеток в областях меристемы

Чтобы исследовать различия между растениями WT и OsVIL1 OX на клеточном уровне, мы проанализировали размер и количество клеток в первом междоузлии примерно на 149 DAS. Во-первых, мы проверили область удлинения междоузлия. Продольный разрез области показал, что количество и размер клеток у растений OsVIL1 OX не были значительно увеличены по сравнению с таковыми у WT ( рисунок 5A и дополнительный рисунок S2 ). Это наблюдение позволяет предположить, что увеличение высоты растений не связано с размером клеток. Чтобы оценить, наблюдается ли увеличение высоты растений в OsVIL1Трансгенные линии OX были обусловлены увеличением количества клеток, область меристемы в базальных частях первого междоузлия исследовали примерно через 149 дней после посева (DAS) на рисовом поле ( Фигура 5B). Размер и количество клеток анализировали на площади образца 0,2 мм 2 в зоне деления после продольных срезов. Анализ показал, что размер клеток растений OsVIL1 OX уменьшился приблизительно до 52% и 30% по длине и ширине соответственно ( фиг . 5C ). Напротив, количество клеток было значительно увеличено примерно до 180% у растений OsVIL1 OX по сравнению с сегрегированными растениями дикого типа ( фиг . 5D). Эти результаты показали, что OsVIL1 способствует делению клеток в области меристемы стебля.

Рисунок 5. Продольный срез первого междоузлия растений дикого типа (WT) и растений со сверхэкспрессией OsVIL1 (OX). ( A ) Анализ продольного сечения зоны удлинения от первых междоузлий в линии WT и OsVIL1 OX # 1 примерно в 149 DAS. Бары = 200 мкм. ( B ) Анализ продольного сечения зоны меристемы от первых междоузлий примерно на 149 DAS. Бары = 200 мкм. ( C ) Сравнение длины и ширины клеток в верхних 0,5 см области клеточного деления в первом междоузлии линий WT и OsVIL1 OX # 1, n = 30 клеток из трех отдельных растений. ( Д) Сравнение номеров ячеек. Клетки подсчитывали на пробе площадью 0,2 мм 2 в области меристемы междоузлия. Планки погрешностей указывают стандартные отклонения, n = статистическая значимость обозначена *** ( p <0,001), ** ( p <0,05).

2.4. OsVIL1 подавляет экспрессию OsCKX2

Ранее мы показали, что экспрессия генов, связанных с клеточным делением/клеточным циклом, клеточной организацией, синтезом ДНК и синтезом белка/активацией аминокислот, была увеличена в растениях OsVIL2 OX [ 7 ]. Мы также сообщили, что OsVIL2 подавляет экспрессию OsCKX2 , который кодирует фермент, разрушающий цитокинин [ 7 ]. Понижающая регуляция OsCKX2 вызывает накопление активного цитокинина, который способствует делению клеток у OsVIL2 OX растений [ 7 ]. Здесь мы исследовали, влияет ли OsVIL1 также на экспрессию OsCKX2 . Анализ образцов из зон клеточного деления показал, что OsCKX2экспрессия была значительно снижена в растениях OsVIL1 OX по сравнению с WT ( фиг . 6B ). Однако уровни транскриптов GA 2-оксидазы 1 ( GA2ox1 ), которая контролирует гомеостаз GA путем инактивации биоактивного GA посредством 2β-гидроксилирования [ 28 ], существенно не изменились ( рис. 6 C). Точно так же уровни экспрессии LP , DST и OsSPL14 , которые регулируют размер метелки и урожай зерна [ 29 , 30 ], не различались между растениями WT и OsVIL1 OX ( рис. 6 D-F). Наши результаты показывают, что OsVIL1повышает уровень активного цитокинина за счет контроля экспрессии OsCKX2 .

Рисунок 6. Уровни экспрессии нескольких генов, регулирующих высоту растения и урожай зерна, в растениях со сверхэкспрессией OsVIL1 (OX). Образцы готовили из зон деления клеток (0,5 см) первых междоузлий (4 см) в условиях рисового поля. Уровни экспрессии OsVIL1 ( A ), OsCKX2 ( B ), OsGA2ox1 ( C ), OsLP1 ( D ), OsDST ( E ) и OsSPL14 ( F ) в первом междоузлии. Убиквитин1 риса использовали в качестве внутреннего контроля. Столбики погрешностей показывают стандартные отклонения,n = Статистическая значимость обозначена *** ( p <0,001).

2.5. OsVIL1 напрямую подавляет экспрессию OsCKX2, регулируя состояния хроматина H3K27

OsVIL2 репрессирует экспрессию OsCKX2 , регулируя состояние хроматина H3K27me3 [ 7 ]. Чтобы исследовать, усиливает ли OsVIL1 также H3K27me3 в хроматине OsCKX2 , мы создали трансгенные растения, которые экспрессировали OsVIL1, меченный Myc, а также только Myc в качестве отрицательного контроля. Для проведения анализа иммунопреципитации хроматина (ChIP) базальные части второго междоузлия собирали перед стадией колошения. Когда мы наблюдали уровни H3K27me3 в хроматине OsCKX2 с использованием антител H3K27me3 ( рис . 7А ), хроматин OsCKX2 был значительно обогащен в трансгенных растениях OsVIL1-Myc по сравнению с трансгенными растениями, экспрессирующими только Myc-tag ( фиг. 7 ).С). Более того, когда мы наблюдали прямое связывание OsVIL1 в области хроматина OsCKX2 с использованием антител против Myc, белки OsVIL1-Myc были обогащены в участках хроматина OsCKX2 P4 и P7-P9 ( рис. 7 E). В качестве отрицательного контроля мы использовали LP , который не был значительно обогащен трансгенными растениями OsVIL1-Myc ( рис. 7 D, F).

Рисунок 7. Анализ иммунопреципитации хроматина OsVIL1 в хроматине OsCKX2 . Образцы готовили из верхних 0,5 см области клеточного деления во втором междоузлии перед стадией колошения, n = 10. ( A , B ) Геномная структура OsCKX2 и OsLP . Трансгенные растения OsVIL1-Myc использовали для анализа иммунопреципитации хроматина. В качестве контроля использовали Myc-пустые трансгенные растения. ( C , D ) Анализ состояний хроматина H3K27me3 в хроматине OsCKX2 ( C ) и OsLP ( D ). ( Э , Ф) Обогащение хроматина OsCKX2 ( E ) и OsLP ( F ) в трансгенных растениях OsVIL1-Myc. Весь эксперимент проводился три раза, и показанный график относится к одному из трех экспериментов. Столбики погрешностей показывают стандартные отклонения. Статистическая значимость обозначена *** ( p < 0,001), * ( p < 0,01).

3. Обсуждение

3.1. OsVIL1 участвует в ремоделировании хроматина в рисе

Геном риса содержит четыре VIN3 - подобных гена ( OsVIL1–OsVIL4 ), которые гомологичны VIN3 Arabidopsis [ 31 ]. Они состоят из пальца PHD, который является консервативным мотивом для связывания гистонов, домена FNIII и домена VID [ 20 , 21 , 25 ]. Палец PHD OsVIL2 связывается с нативным гистоном H3 in vitro и индуцирует модификацию гистона H3K27me3 в хроматине генов-мишеней [ 7 , 23 ].]. В этом исследовании мы показали, что OsVIL1 также модифицирует состояния хроматина, регулируя H3K27me3 для подавления экспрессии нижестоящих генов. H3K27me3 является эпигенетической модификацией гистона H3 и влияет на стабильность и пластичность регуляции генов во время различных процессов развития. Фактор взаимодействия хроматина OsVIL2 связывается с OsEMF2b, который является коровым белком в комплексе PRC2, и индуцирует цветение путем репрессии OsLFL1 у риса [ 23 ]. Нулевые мутанты osvil2 демонстрируют фенотипы позднего цветения, как и мутанты OsEMF2b . Хотя растения OsVIL2 OX демонстрируют повышенную биомассу и урожай зерна, сверхэкспрессия OsEMF2bнет (неопубликованные данные). Подобно OsVIL2, OsVIL1 подавляет экспрессию генов-мишеней, индуцируя H3K27me. Более того, OsVIL1 связывается с OsEMF2b через домен FNIII [ 25 ]. Однако необходимы дальнейшие исследования для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе того, как взаимодействия между белками OsVIL и OsEMF2b контролируют биомассу и урожайность зерна риса.

3.2. VIN3-подобные белки регулируют деление клеток меристемы риса

Яровизация – это ускорение перехода цветков от вегетативного роста к репродуктивному после длительного воздействия низкой температуры [ 31 , 32 , 33 ]. У арабидопсиса VIN3, который является репрессивным компонентом ремоделирования хроматина, индуцируется только после восприятия достаточно продолжительного холода [ 34 , 35 ]. Белок VIN3 индуцирует триметилирование H3K27 локусов-мишеней для регуляции экспрессии генов. Например, VIN3 увеличивает уровни H3K27me3 в области хроматина FLC и других членах клады FLC [ 18 ]. Рис не требует яровизации для контроля времени цветения и не требует FLC.-гомологичный ген присутствует у риса [ 23 ]. Хотя детальные механизмы контроля времени цветения различаются у риса и арабидопсиса, белки OsVIL1 и OsVIL2 в рисе играют роль в стимулировании цветения за счет снижения экспрессии OsLFL1 , репрессора цветения [ 23 , 25 ].

У риса нулевые мутанты osvil2 демонстрируют плейотропные фенотипы, включая измененное время цветения, уменьшенное количество побегов, изменения углов листа и дефекты развития цветочных органов [ 23 , 26 , 27 ]. Кроме того, растения OsVIL2 OX демонстрируют повышенную биомассу и урожайность зерна, вызванные накоплением активного цитокинина [ 7 ]. В этом исследовании мы показали, что сверхэкспрессия OsVIL1 приводит к фенотипам, сходным с таковыми у растений OsVIL2 OX, включая увеличение биомассы и урожая зерна. Когда мы исследовали состояния модификации гистонов OsCKX2хроматин, ген, ответственный за деградацию цитокинина, OsVIL1 влияет на триметилирование H3K27 в хроматине OsCKX2 , аналогично OsVIL2. Цитокинин играет важную роль в пролиферации клеток и регулировании размера меристемы [ 4 ]. У риса VIN3-подобные белки OsVIL1 и OsVIL2 подавляли экспрессию OsCKX2 , создавая баланс между синтезом цитокинина и катаболизмом для контроля активности меристемы и пролиферации клеток. В свете этих результатов будет интересно изучить, чем VIN3-подобные белки других видов растений отличаются от белков риса и арабидопсиса.

3.3. Потеря функции OsVIL1 вызывает снижение фертильности

Хотя сходные фенотипы наблюдались при сверхэкспрессии OsVIL1 или OsVIL2 , нулевые мутанты osvil1 не демонстрировали заметных фенотипов развития в отличие от нулевых мутантов osvil2 , которые проявляют плейотропные фенотипы. Поскольку и OsVIL1, и OsVIL2 индуцируют триметилирование H3K27 в области хроматина OsCKX2 , мы ожидали, что их домены PHD будут иметь сходные консервативные локусы-мишени. Кроме того, OsVIL1 и OsVIL2 связываются с OsEMF2b, коровым белком комплекса PRC2, через домен FNIII. Нулевые мутанты OsEMF2b демонстрируют аномальную идентичность цветочных органов, уменьшенный размер побегов и плейотропные фенотипы, как у нулевых мутантов osvil2.23 ]. По этим причинам мы предположили, что OsVIL2 функционирует с OsEMF2b в комплексе PRC2, чтобы регулировать клеточное деление и идентичность меристем. Нулевые мутанты в OsVIL1 не вызывают наблюдаемых дефектов развития, за исключением оплодотворения, что указывает на то, что OsVIL2 может восстанавливать большинство функций OsVIL1. Причина сниженной фертильности мутанта osvil1 до сих пор точно не установлена. У osvil2 нет результатов исследований пыльцы или развития пыльников, потому что цветочный орган у этого мутанта полностью разрушен. OsEMF2b, партнер по взаимодействию OsVIL1 и OsVIL2, участвует в развитии пыльников и пыльцы у риса [ 36 ].]. Ожидается, что и OsVIL1, и OsVIL2 играют роль в развитии пыльников и пыльцы, но необходимы дальнейшие исследования для определения более подробных функций.

Однако биомасса и урожай зерна увеличивались, когда OsVIL1 был сверхэкспрессирован, что указывает на то, что OsVIL1 помогает функциям OsVIL2 в регуляции клеточного деления и активности меристемы. Дальнейшие исследования, такие как создание двойных, тройных или четверных мутантов мутантов гена OsVIL, необходимы для выявления подробных молекулярных механизмов взаимодействия между четырьмя белками OsVIL, чтобы определить, как они регулируют различные процессы развития.

4. Материалы и методы

4.1. Растительные материалы и условия роста

Oryza sativa вар. japonica сорта Nipponbare использовали для создания трансгенных растений. Области-мишени для индуцированных CRISPR/Cas9 мутантов osvil1 KO были генотипированы посредством секвенирования ( таблица S1 ). Для секвенирования ДНК целевых областей продукты ПЦР очищали в геле с использованием полимеразы Pfu и подвергали субклонированию. Затем случайным образом отбирали и секвенировали более 10 трансформированных колоний E.coli для каждой линии. Впоследствии мутации ДНК были идентифицированы путем выравнивания последовательностей между секвенированными аллелями и аллелями WT с использованием NCBI BLAST ( https://blast.ncbi.nlm.nih.gov ).(по состоянию на 1 ноября 2021 г.). Семена проращивали либо на среде МС, либо в почве. Мы отобрали две линии T 0 , которые высоко экспрессировали введенный OsVIL1 и переименовали рекомбинантный ген OX # 1 и # . Потомство T 1 выращивали на среде MS, содержащей 40 мкг мл -1 гигромицина. Наконец, растения выращивали либо на рисовом поле, либо в контролируемой комнате для выращивания при цикле свет/темнота (14,5 часов света при 28 °C/10 часов темноты при 23 °C; влажность 50 %), как сообщалось ранее [ 37 ] . .

4.2. Векторная конструкция и преобразование риса

Для получения растений OsVIL1 OX и трансгенных растений, меченных Myc, полноразмерную комплементарную ДНК (кДНК) OsVIL1 амплифицировали и расщепляли рестрикционными ферментами Spe I и Sac I и вставляли в бинарный вектор pGA3426, который содержит промотор убиквитина 1 ( Ubi1 ) кукурузы. или pGA3438, который содержит промотор Ubiquitin1 ( Ubi1 ) кукурузы и эпитоп Myc [ 38 ]. Для конструирования плазмиды CRISPR/Cas9 целевую последовательность клонировали в вектор входа pOs-sgRNA; затем целевую последовательность и sgRNA дополнительно клонировали в целевой вектор, pH-Ubi-cas9-7, с использованием Gateway TMкак сообщалось ранее [ 39 , 40 ]. Конструкции вводили в Agrobacterium tumefaciens LBA4404 методом замораживания-оттаивания [ 41 ]. Трансформацию риса посредством совместного культивирования, опосредованного Agrobacterium, проводили, как описано ранее [ 42 ]. Все праймеры, использованные для клонирования, перечислены в таблице S1 .

4.3. Экстракция РНК и ПЦР-анализ в реальном времени

Для выделения РНК образцы размером 0,5 см отбирали с листовых пластинок или базальных частей первого и второго междоузлий. Тотальную РНК выделяли с помощью RNAiso Plus (Takara, Киото, Япония) и 2 мкг тотальной РНК гибридизовали с 10 нг олиго (dT). Первую цепь кДНК синтезировали с помощью обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (Promega, Фитчбург, Висконсин, США), РНКазина (Promega, Фитчбург, Висконсин, США) и 2,5 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфата. Уровни транскриптов анализировали с помощью количественной RT-PCR (qRT-PCR) с использованием смеси SYBR Green I Prime Q-Master (GENETBIO, Тэджон, Корея) в системе Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Германия) [ 39 ]. Для нормализации мы использовали ген риса Ubiquitin1 ( OsUbi1 ) или Actin1 ( OsActin1 ).) в качестве внутреннего контроля. Относительный уровень экспрессии рассчитывали методом ΔΔCt. Все праймеры, использованные для qRT-PCR, перечислены в таблице S1 .

4.4. Гистохимический анализ

Для наблюдения за развитием междоузлий использовали парафин для получения срезов образцов первого междоузлия. Образцы отбирали из базальной и средней частей первого междоузлия и фиксировали раствором ФУК, как сообщалось ранее [ 43 ]. Затем образцы обезвоживали и пропитывали парафином перед заливкой в ​​кольцо. Образцы нарезали до толщины 10 мкм, регидратировали и окрашивали толуидиновым синим для наблюдения за дифференцировкой и удлинением клеток. Образцы визуализировали с использованием микроскопа BX61 (Olympus, Токио, Япония).

4.5. Анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP)

Трансгенные растения, экспрессирующие OsVIL1-Myc, использовали для анализа ChIP, как сообщалось ранее [ 44 ]. Вкратце, около 2 г базальных частей от вторых междоузлий собирали и инкубировали в 3% формальдегиде; затем ядра изолировали. Хроматин фрагментировали примерно до длины от 500 до 1000 п.н. с помощью ультразвука. Перед предварительной очисткой в ​​качестве исходного материала отбирали 1% пробы. Для иммунопреципитации мы использовали моноклональные антитела против Myc (#2276; Cell Signaling, Bethesda, MD, USA), как описано ранее [ 23 , 39 ]. Данные были нормализованы в соответствии с методом процентного ввода, как сообщалось ранее [ 45 ]. Последовательности праймеров, используемые для анализа ChIP, перечислены в таблице S1 .. Все эксперименты проводили не менее трех раз, каждый из которых включал три биологические повторности.

4.6. Статистический анализ

Используя программное обеспечение R, значения p были получены с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA; критерий Тьюки HSD) для испытуемых групп [ 46 ].

4.7. Филогенетический анализ

Ортологичные и/или близко паралогичные гены OsVIL1 среди 44 репрезентативных растений были идентифицированы с использованием конвейера OrthoFinder (версия 2.5.1) [ 47 ]. Впоследствии, как сообщалось ранее, были восстановлены филогенетические отношения между этими генами VIL [ 48 ]. Вкратце, множественное выравнивание кодирующих последовательностей из идентифицированных генов VIL выравнивали с помощью MAFFT (версия 7.243) [ 49 ]. Затем филогенетическое дерево Neighbor-Joining (NJ) было выведено с помощью MEGA6 [ 50 ] с начальной загрузкой = 1000.

4.8. Анализ метавыражений

Для анализа тканеспецифических паттернов экспрессии генов OsVIL мы использовали сайт базы данных CAFRI-Rice ( http://cafri-rice.khu.ac.kr/spector (по состоянию на 20 декабря 2021 г.) [ 51 ] на основе общедоступных рисовых данных Affymetrix . набор данных микрочипа из NCBI Gene Expression Omnibus (GEO).Значения выражения нормализуются языком R, а затем превращаются в значения log2. С загруженными значениями выражения log2 мы построили тепловую карту с помощью программы инструментов TB [ 52 ].