УВЕЛИЧЕНИЕ ПОТЕНЦИАЛА ФИТОЭКСТРАКЦИИ ЗА СЧЕТ РЕДАКТИРОВАНИЯ И ТРАНСФОРМАЦИИ ГЕНОМА: ОБЗОР

Увеличение потенциала фитоэкстракции за счет редактирования и трансформации генома: обзор

Хавьера Венегас-Риосеко

Розанна Джиноккио

Клаудия Ортис-Кальдерон

Загрязнение почвы металлами, связанное с производственной деятельностью, является глобальной проблемой. Металлы не поддаются биологическому разложению и имеют тенденцию накапливаться в почве, создавая потенциальные риски для окружающих экосистем и здоровья человека. Были разработаны растительные методы (фитотехнологии) для восстановления на месте почв, загрязненных металлами, но они имеют некоторые ограничения. Фитотехнологии представляют собой группу технологий, использующих способность определенных растений восстанавливать почвенные, водные и воздушные ресурсы для восстановления экосистемных услуг в управляемых ландшафтах. Что касается загрязнения почвы металлами, основными задачами являются стабилизация на месте (фитостабилизация) и удаление загрязнителей (фитоэкстракция). Стратегии генной инженерии, такие как редактирование генов, группирование генов и трансформация, среди прочего, может улучшить фитоэкстракционный потенциал растений за счет повышения их способности накапливать и переносить металлы и металлоиды. В этом обзоре обсуждаются проверенные стратегии повышения эффективности фитоэкстракции и перспективы развития фитотехнологий на будущее.

Ключевые слова: металлическая рекультивация почв ; металлофиты ; гипераккумуляторы ; фиторемедиация

1. Введение

Из-за промышленной, горнодобывающей и сельскохозяйственной деятельности повышение концентрации ТМ в почве стало актуальной глобальной проблемой [ 1 , 2 ]. Хотя ТМ являются природными соединениями, антропогенная деятельность является основной причиной биогеохимических изменений, увеличивающих концентрацию ТМ в почве намного выше естественного уровня. Загрязнение земель ТМ представляет серьезную опасность для здоровья человека и экосистем [ 1 , 3 ]. У людей высокие уровни ТМ в живых тканях вызывают серьезные нарушения работы органов, неврологические расстройства и, в конечном итоге, смерть [ 4 ]. С другой стороны, высокая концентрация ТМ в почве снижает микробные и растительные популяции, разнообразие и функционирование экосистемы [ 2 ].

Понимание доступности любого металла в почве для растений является сложным и многофакторным, поскольку необходимо учитывать взаимодействие между тяжелыми металлами и другими компонентами почвы, а также видовую способность извлекать металлы из почв [ 5 ]. Действительно, токсичность почвенного металла для растений зависит от биодоступности металла в почве, которая варьируется в зависимости от нескольких факторов, таких как pH, присутствие конкурирующих катионов и содержание органического вещества почвы (SOM) [ 6 , 7 ].

Воздействие высоких концентраций ТМ может вызвать серьезные последствия для роста и развития растений, такие как ингибирование фотосинтеза, нарушение целостности клеточных мембран, побурение корней, межжилковый хлороз и, наконец, увядание и гибель [ 8 , 9 , 10 ]. Все эти эффекты являются результатом образования активных форм кислорода (АФК), таких как супероксид (O 2 •− ), перекись водорода (H 2 O 2 ) и гидроксильные радикалы (OH • ), в результате реакций Габера-Вейсса и Фентона [ 10 ]. , 11]. АФК повреждают основные клеточные компоненты, такие как ДНК (деградация), белки (денатурация) и липиды (окисление). Таким образом, индукция продукции АФК приводит к окислительному стрессу, влияющему на рост растений, прорастание семян, производство биомассы растений, длину корней и биосинтез хлорофилла. Кроме того, нарушаются и различные другие физиологические процессы, такие как минеральное питание, дыхание, фотосинтетическая деятельность, ферментативные реакции и изменения антиоксидантной системы [ 10 , 11 , 12 , 13 ].

В целом растения чувствительны к повышенным концентрациям биодоступных фракций ТМ в почвах [ 14 ]. Однако некоторые растения, известные как металлофиты, выработали механизмы толерантности, чтобы справляться со стрессом ТМ [ 15 ]. Некоторые металлофиты, известные как гипераккумуляторы, также разработали механизмы для накопления особенно повышенных уровней некоторых ТМ в своих надземных тканях, которые могут быть в несколько сотен или тысяч раз выше, чем у нормальных растений (на два-три порядка больше, чем обычно). обнаруживаются у растений, произрастающих на почвах, не обогащенных определенными металлами) [ 14]. Металлофиты обладают антиоксидантными стратегиями, чтобы справиться с окислительным повреждением, вызванным тяжелыми металлами. К ним относятся ферменты, удаляющие АФК, такие как супероксиддисмутаза (SOD), каталазы (CAT), гваяколпероксидаза (GPX), аскорбатпероксидаза (APX) и глутатионредуктаза (GR), а также низкомолекулярные поглотители антиоксидантов, такие как аскорбат. ASC) и глутатион (GSH). Металлофиты также выработали определенные механизмы толерантности к ТМ, включая исключение металлов, накопление металлов, хелатирование металлов и связывание металлов сильными лигандами, такими как белки, богатые цистеином, включая металлотионеины (МТ) и богатые тиолом пептиды, называемые фитохелатины (ПК). [ 11 , 13 , 16 ].

2. Технология фитоэкстракции

За последние три десятилетия появились и развились экологически безопасные методы восстановления почвы на месте с использованием видов растений, известных как фитотехнологии. Фитотехнологии обычно считаются менее инвазивными, более рентабельными, более безопасными для окружающей среды и более восстанавливающими почву, чем традиционные методы, такие как химическая и физическая реабилитация [ 17 , 18 ]. Фиторемедиация — это технология, основанная на использовании растений (т. е. деревьев, кустарников, трав и злаков) и ассоциированных с ними микроорганизмов (т. е. бактерий и арбускулярных микоризных грибов (АМФ)), используемых для удаления (фитоэкстракция), деградации (фитодеградация) или иммобилизации ( фитостабилизация) токсичных веществ в матрицах окружающей среды, таких как почва и вода [ 3]. Фиторемедиация использует способность некоторых растений поглощать, накапливать, метаболизировать, улетучиваться или стабилизировать загрязняющие вещества в почве, воздухе, воде или отложениях [ 19 ]. Например, растения могут снижать биодоступные концентрации загрязнителей почвы, таких как тяжелые металлы (Pb, Zn, Cd, Cu, Ni, Hg), металлоиды (As, Sb), неорганические соединения (NO 3 - NH 4 + , PO 4 3- ) , радиоактивные изотопы, углеводороды (например, дизельное топливо) или пестициды и гербициды (атразин, бентазон, хлорированные и нитроароматические соединения), восстанавливая таким образом функции почвы [ 20 , 21 ].

Фитоэкстракция относится к способности определенных растений поглощать (удалять) загрязняющие вещества из почвы корневой системой растений и последующую их транслокацию и накопление в побеге или любой части растения, пригодной для сбора урожая [ 22 , 23 ]. Установки-гипераккумуляторы могут использоваться для извлечения металлов, а также неорганических и органических загрязнителей из почвы [ 24 , 25 ]. Эти растения способны накапливать ТМ в пределах 0,01–1 % от сухого веса в надземных тканях [ 21 , 26 ]. В частности, установка-гипераккумулятор может концентрировать более 10 мг/кг Hg ; 100 мг·кг -1 Cd; 1000 мг/кг Co , Cr, Cu или Pb; или 10 000 мг кг−1 Zn или Ni [ 27 , 28 ]. Предложено использование гипераккумуляторов для очистки загрязненных металлами почв (биодоступная фракция) [ 29 ]. Однако встречающиеся в природе гипераккумуляторы, как правило, представляют собой медленнорастущие растения, которые производят относительно небольшое количество собираемой надземной биомассы [ 30 ], что ограничивает их потенциал фитоэкстракции.

2.1. Применение фитоэкстракции на месте

В последние годы было предложено и принято множество технологий восстановления, включая физические, химические, биологические и комбинированные методы для смягчения загрязнения почвы [ 31 ]. В случае технологии фитоэкстракции выбор подходящих видов растений является одним из наиболее важных соображений. Подходящие виды растений должны быть способны переносить высокие уровни ТМ и другие ограничивающие почвенные условия, такие как высокая кислотность, соленость или щелочность [ 32 ]. В некоторых случаях, например, в полузасушливых горнодобывающих районах, виды растений также должны быть способны адаптироваться к засухе и высокому световому излучению. Поэтому часто выбирают устойчивые к металлам местные растения, поскольку они демонстрируют устойчивость к местным условиям окружающей среды и могут легко расти и размножаться [ 33 ].].

Фитоэкстракция бобовых культур in situ считается экологически безопасным способом восстановления хвостохранилищ. Исследования Ю и соавт. (2019) использовали бобовые ( Pongamia pinnata ) для анализа изменений микробных структур во время фитоэкстракции. Они отслеживали динамические изменения микробиоты в ризосфере Pongamia pinnata во время двухлетней рекультивации на месте хвостохранилищ ванадиево-титанового магнетита. После рекультивации общее санитарное состояние почвы значительно улучшилось: увеличилось содержание доступных N и P, была обнаружена активность ферментов, а также увеличилось содержание углерода и азота в микробах. Это исследование показало, что фиторемедиация бобовых может эффективно вызывать сдвиг микробных сообществ в пользу ризобий в почве, загрязненной тяжелыми металлами [ 34 ].

Даже декоративные цветы или травы могут обладать потенциалом фитоэкстракции [ 35 , 36 ].]. Было проведено полевое исследование для оценки эффективности лаванды для фиторемедиации загрязненных почв. Эксперимент проводился на сельскохозяйственном поле, загрязненном заводом по производству цветных металлов недалеко от Пловдива, Болгария. Оценивали концентрации Pb, Zn и Cd в лаванде (корнях, стеблях, листьях и соцветиях) и в эфирных маслах лаванды. Лаванда является толерантным к ТМ растением, которое можно выращивать на загрязненных почвах, и ее можно отнести к гипераккумуляторам свинца и аккумуляторам кадмия и цинка. Эта способность может быть успешно использована для фиторемедиации почв, загрязненных тяжелыми металлами. Показано, что почвенные ТМ не влияют на развитие лаванды, качество и количество эфирного масла лаванды.37 ].

Совместная посадка культур широко используется в сельском хозяйстве, поскольку она может увеличить общую урожайность за счет повышения эффективности использования ресурсов [ 38 ]. Сюн и др. (2018) изучали фитоэкстракционные эффекты совместной посадки Ricinus communis или бобовых ( Medicago sativa ) в почве, загрязненной Cd и Zn. Для эксперимента было выбрано место передислокации фабрики в Шанхае, загрязненное Cd и Zn. По результатам оценки потенциального экологического риска ТМ исследуемая территория была разделена на три уровня загрязнения: слабый, умеренный и высокий. Результаты показали, что присутствие Medicago sativa может значительно увеличить рост и биомассу R. communis., и было большее влияние на содержание хлорофилла R. communis при более высоких уровнях загрязнения. Различия в уровнях загрязнения могут значительно изменить содержание масла в растениях R. communis , но M. sativa может смягчить воздействие ТМ. Присутствие M. sativa увеличивало количество Cd и Zn в R. communis в 1,14 и 2,19 раза соответственно. Таким образом, совместная посадка R. communis и бобовых восстанавливает загрязненную почву и может быть практической стратегией фитоэкстракции in situ для почвы, загрязненной тяжелыми металлами [ 39 ].

2.2. Преимущества и ограничения фитоэкстракции

Эффективность фитоэкстракции загрязнителей металлов из почвы зависит от трех основных факторов: (1) эффективного поглощения и переноса металлов в надземные части растений; (2) способность накапливать и переносить высокие уровни металла; и (3) хорошо развитая корневая система и обильное производство биомассы побегов. Традиционные методы фитоэкстракции сталкиваются с определенными ограничениями, такими как длительное время, необходимое для восстановления почвы (например, несколько сезонов урожая), восстановление ограничивается слоями почвы, где могут развиваться корни, и ограниченная способность экстракции из-за небольшого производства надземной биомассы [ 21 ]. . Другим ограничением является то, что только небольшая фракция металлов в почве обычно биодоступна для растений (биодоступная фракция) [ 40 ].]. Наконец, этот метод применим только к участкам с низким или умеренным загрязнением металлами [ 21 , 41 ].

Недавно были предложены подходы, основанные на химических или микробиологических методах фитоэкстракции, для улучшения восстановления металлов в почве, особенно в больших масштабах [ 42 ]. Чтобы справиться с некоторыми ограничениями растений для надлежащей фитоэкстракции металлов из почвы, инструменты генной инженерии могут быть использованы для создания трансгенных растений с более высоким производством биомассы в воздухе и повышенной устойчивостью к металлам и способностью к накоплению, которые также хорошо адаптированы к различным климатическим условиям [ 43 ].]. С помощью стратегий генной инженерии, таких как редактирование генов, группирование генов, трансформация и сверхэкспрессия стратегических генов, среди прочего, можно улучшить способность растений накапливать и переносить ТМ. В этом обзоре будут обсуждаться некоторые стратегии повышения эффективности фитоэкстракции.

3. Стратегии генной инженерии для повышения эффективности фитоэкстракции

3.1. Улучшение накопления металла

Гомеостаз металлов необходим для роста, развития и адаптации растений к различным факторам стресса окружающей среды [ 44 ]. Следовательно, у растений есть специфические переносчики, которые жестко регулируют поглощение, распределение и использование ионов металлов и, таким образом, поддерживают окислительно-восстановительный гомеостаз [ 45 , 46 , 47 ]. Новые биотехнологические методы позволили лучше понять молекулярные механизмы растений и улучшить их с помощью генной инженерии. Например, редактирование генов отдельных растений позволяет улучшить определенные способности или способности [ 48 ].]. Редактирование генома может сделать технологии фитоэкстракции более эффективными, экономящими время и экономически целесообразными, сводя к минимуму ограничения и обеспечивая широкомасштабное применение [ 42 ]. Гены, которые в настоящее время широко используются для улучшения фитоэкстракционного потенциала растений, кодируют переносчики ионов металлов [ 49 ].]. Сверхэкспрессия ключевых белков, таких как металлсвязывающие белки или переносчики металлов, может усиливать поглощение и накопление ТМ. Среди транспортеров важную роль в поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза играют различные семейства, в том числе члены семейства Zn/Fe-регулируемых транспортеров (ZRT/IRT-related ZRT-IRT-like белков (ZIP)) и белок макрофагов, ассоциированный с естественной резистентностью (NRAMP) семейство, семейство облегчителей катионной диффузии (CDF), семейство желтых полосообразных (YSL), семейство главных фасилитаторов супер (MFS), семейство АТФаз тяжелых металлов P1B-типа (HMA), семейство вакуолярных переносчиков железа (VIT) и катионный обмен (CAX), среди прочих [ 50 , 51 , 52 ].

Гиперэкспрессия переносчиков металлов

Шим и др. (2013) получили генетически сконструированные линии тополя Бонхва ( Populus alba x P. tremula var . ironulosa), экспрессирующие ген дрожжей ScYCF1 ( Saccharomyces cerevisiae - дрожжевой кадмиевый фактор 1), который кодирует вакуолярный транспортер, участвующий в секвестрации токсичных металлов в вакуоли. При выращивании на загрязненной тяжелыми металлами почве с места добычи, растения, экспрессирующие ScYCF1, демонстрировали снижение симптомов токсичности Cd и накапливали больше Cd по сравнению с дикими растениями ( WT ) [ 53 ]. При тестировании растений в загрязненной почве сухая масса корней и накопление Cd, Zn и Pb в трансгенных корнях были выше, чем у WT., демонстрируя потенциальное использование этих линий в долгосрочной фитоэкстракции и фитостабилизации сильно загрязненных почв [ 15 , 53 ].

Гены ZIP представляют важное семейство транспортеров, которые высоко консервативны среди видов (планов, грибов и животных) [ 54 ]. Члены этого семейства генов отвечают за транспорт различных катионов, включая Fe, Mn и Zn [ 54 ]. Они также могут быть вовлечены в транспортировку несущественных и высокотоксичных ТМ, таких как Cd. Цзян и др. (2021), которые исследовали функцию гена SmZIP , выделенного из Salix matsudana, и его роль в толерантности, поглощении, транслокации и распространении Cd [ 55 ]. Путем сверхэкспрессии переносчика SmZIP в трансгенном табаке они обнаружили, что фитотоксические эффекты, вызванные Cd-стрессом, были снижены по сравнению с WT.растения. Кроме того, по сравнению с табаком WT в трансгенном табаке увеличилось содержание Cd в корнях, стеблях и листьях, а также увеличилось содержание Zn, Fe, Cu и Mn. Кроме того, трансгенный табак SmZIP продемонстрировал более высокую скорость роста и показал более энергичный фенотип. Сверхэкспрессия SmZIP приводила к перераспределению Cd на субклеточном уровне, снижению доли Cd в клеточных стенках и увеличению Cd в растворимой фракции как корней, так и листьев. Таким образом, сверхэкспрессия SmZIP играет важную роль в накоплении и транслокации Cd, субклеточном распределении и химических формах в трансгенном табаке при стрессе Cd [ 55 ].

Другим хорошо изученным семейством транспортеров является семейство АТФ-связывающих кассетных транспортеров, такое как AtATM3 . AtATM3 локализуется на митохондриальной мембране Arabidopsis thaliana и участвует в биогенезе кластеров Fe-S и гомеостазе Fe у растений. Путем генетической трансформации, опосредованной Agrobacterium , Bhuiyan et al. (2011) сверхэкспрессировали ген AtATM3 в Brassica juncea (индийская горчица), вид растений, пригодный для фитоэкстракции. Сверхэкспрессия AtATM3 у B. junceaпридавали повышенную толерантность к стрессорам Cd (II) и Pb (II). Трансгенные проростки показали значительное увеличение накопления как Cd (II), так и Pb (II). Повышенная толерантность и накопление ТМ трансгенными растениями AtATM3 объясняются более высокими уровнями экспрессии BjGSHII ( глутатионсинтетаза II B. juncea ) и BjPCS1 (фитохелатинсинтаза 1), индуцированными сверхэкспрессией AtATM3 . Следовательно, трансгенные растения AtATM3 более устойчивы к ТМ и могут накапливать больше ТМ для усиления фитоэкстракции в загрязненных почвах [ 56 ]. Точно так же L. Sun et al. (2018) выделили ген транспортера АТФ-связывающей кассеты (ABC) PtABCC1 изPopulus trichocarpa и сверхэкспрессировал его у арабидопсиса и тополя. Трансгенные растения обладали более высокой толерантностью к Hg, чем растения WT , а сверхэкспрессия PtABCC1 приводила к увеличению накопления Hg на 26–72% в арабидопсисе , на 7–31% в листьях тополя и на 26–160% в стебле тополя. Эти результаты показали, что PtABCC1 играет решающую роль в толерантности и накоплении Hg в растениях и, таким образом, является подходящей стратегией для улучшения фитоэкстракции Hg [ 57 ].

Другим примером увеличения способности поглощения ТМ растениями является усиление фитоэкстракции Cd за счет сверхэкспрессии облегчителя диффузии катионов (семейство CDF) или белка толерантности к металлам/транспорта (семейство MTP). Дас и др. (2016) выделили и функционально охарактеризовали ген OsMTP1 из риса Indica ( Oryza sativa L. cv. IR64) для изучения потенциального применения этого переносчика для повышения эффективности фитоэкстракции Cd [ 46 ]. Гетерологическая экспрессия OsMTP1 в табаке приводила к снижению индуцированных Cd-стрессом фитотоксических эффектов, включая ингибирование роста, перекисное окисление липидов и гибель клеток. По сравнению с ВТ ., трансгенные растения табака показали повышенное содержание тиолов в вакуолях, что указывает на вакуолярную локализацию секвестрированного Cd. Трансгенные растения табака демонстрировали значительно более высокую продукцию биомассы (в 2,2–2,8 раза) и гипераккумуляцию (в 1,96–2,22 раза) Cd по сравнению с WT при воздействии Cd. Трансгенные растения также показали умеренную толерантность и накопление As при воздействии As. Эти результаты свидетельствуют о том, что трансгенные растения табака, сверхэкспрессирующие OsMTP1 , могут быть полезны в будущих применениях фитоэкстракции для очистки почв, загрязненных кадмием, что также показано результатами Bhuiyan et al. (2011) [ 56 ] и Sun et al. (2018) [ 57 ].

В растениях Cu действует как незаменимый кофактор многочисленных белков, выполняющих центральные функции в клетках. Поскольку Cu является важным микроэлементом, у растений есть особые механизмы не только для его исключения или хелатирования, но и для транспортировки в клетки [ 58 ]. Преобладающим механизмом транспортировки Cu является восстановление иона плазматической мембраны NADPH-зависимыми редуктазами меди [ 59 ] и последующее поглощение металла высокоаффинными переносчиками Cu+ семейства COPT под контролем Cu-чувствительного фактора транскрипции SPL7. (белок, подобный промотору SQUAMOSA7) [ 59 , 60 , 61 , 62]. Исследования, проведенные Andrés-Colás et al. (2010) показали, что трансгенные растения, сверхэкспрессирующие либо COPT1, либо COPT3, обнаруживают повышенные внутриклеточные уровни Cu и являются чувствительными к Cu в питательной среде [ 63 ]. Точно так же Sanz et al. (2019) экспрессировали транспортеры COPT2 в гетерологичной системе, такой как ооциты африканской шпорцевой лягушки Xenopus laevis . Они заметили, что содержание Cu в ооцитах, экспрессирующих переносчик COPT2, увеличилось, накапливая Cu в 6 раз больше, чем контрольные ооциты. Эти результаты позволяют предположить, что сверхэкспрессия белков семейства высокоаффинных транспортеров COPT может увеличить способность растений поглощать медь [ 61 ].

Поглощение и транслокация заменимых ТМ в растениях происходит с помощью переносчиков металлов основных питательных микроэлементов, таких как белок макрофагов, ассоциированный с естественной резистентностью (NRAMP). NRAMP разных видов обладают разными биологическими функциями, хотя их последовательности имеют сходство [ 64 , 65 , 66 ]. Ван и др. (2019) выделили NRAMP6 из Ailanmai ( Triticum turgidum L. ssp. turgidum), который кодирует белок плазматической мембраны. Экспрессия TtNRAMP6 в дрожжах значительно повышала концентрацию Cd, поэтому клетки были более чувствительны к Cd. Кроме того, избыточная экспрессия TtNRAMP6 увеличивает концентрацию Cd в корнях, стеблях, листьях и целом растении Arabidopsis, что указывает на то, что избыточная экспрессия TtNRAMP6 усиливает накопление Cd [ 62 ].

3.2. Стратегии повышения толерантности к металлам

Растения разработали ряд механизмов детоксикации избытка металлов, таких как компартментализация в неактивных тканях, хелатирование металлическими лигандами и детоксикация антиоксидантами. Хелаторы металлов, такие как органические кислоты, аминокислоты, фитохелатины и металлотионеины, играют важную роль в детоксикации металлов [ 67 ].

3.2.1. Сверхэкспрессия белков, связывающих металлы

Металлотионеины (МТ) представляют собой низкомолекулярные, богатые цистеином белки, которые широко распространены в микроорганизмах, растениях и животных. Эти белки могут связывать металлы и образовывать сложные биохимические структуры [ 68 ]. МТ играют фундаментальную роль в гомеостазе металлов, детоксикации и удалении активных форм кислорода (АФК) [ 69 ]. Многочисленные исследования наблюдали экспрессию растительных МТ в ответ на различные стрессоры ТМ, включая стресс Cu, Zn и Cd. Сверхэкспрессия некоторых МТ приводит к повышенной толерантности к металлам [ 69 ]. Сверхэкспрессия металлотионеина 1 Elsholtzia haichowensis (EhMT1) в растениях табака повышает толерантность к Cu и его накопление в цитоплазме корней, снижая содержание пероксида водорода (H 2 O2 ) производство [ 68 ]. Другой стратегией повышения толерантности к ТМ является сверхэкспрессия гена ThMT3 ( металлотионеин 3 Tamarix hispida в Salix matsudana ), который, как было обнаружено, повышает толерантность к Cu, выработку оксида азота (NO) и высвобождение NO, что способствует индукции адвентивных инфекций. корни в условиях Cu стресса. Было показано, что применение NO вызывает транскрипцию и накопление МТ в листьях, что указывает на возможные функции NO и МТ в ответ на ТМ. NO является важной газосигнальной молекулой, участвующей во многих процессах развития и физиологических процессах, включая защитные реакции растений против токсичных металлов [ 70 ].

Гу и др. (2014) выделили полноразмерный гомолог кДНК MT2a (металлотионеин типа 2) из ​​Cd-толерантных видов Iris lactea var. китайский . Экспрессия ILMT2a у I. lactea var. chinensis в корнях и листьях активировалась в ответ на стресс Cd [ 71 ]. Когда ген конститутивно экспрессировался в A. thaliana , корни трансгенных линий были длиннее, чем у WT при стрессе 50 мкМ или 100 мкМ Cd. Однако различий в поглощении Cd между линиями дикого типа и трансгенными линиями обнаружено не было. Трансгенные линии накапливали заметно меньше H 2 O 2 и O2 •- (ион супероксида), чем WT . Эти результаты показывают, что ILMT2a может быть многообещающим геном для улучшения устойчивости растений к Cd. Точно так же Zhang et al. (2014) выделили ген металлотионеина типа 2, SaMT2 , из когипераккумулятора Cd/Zn Sedum alfredii Hance [ 72 ]. Экотип представлял собой гипераккумулятор Zn/Cd, обнаруженный в старом районе добычи Pb/Zn в Китае [ 73 ], который может накапливать до 9000 мг/г Cd и 29 000 мг/г Zn в побегах без симптомов токсичности [ 74 ].]. Такое большое количество металлов в растительных клетках требует мощной системы детоксикации для защиты растений от вредных воздействий. SaMT2 кодирует предполагаемый пептид из 79 аминокислотных остатков, включая два богатых цистеином домена. Уровень транскрипта SaMT2 был выше в побегах, чем в корнях S. alfredii , и значительно индуцировался обработкой Cd и Zn. Экспрессированный в дрожжах SaMT2 значительно повышал толерантность и накопление Cd. Эктопическая экспрессия SaMT2 в табаке повышала толерантность к Cd и Zn и их накопление как в побегах, так и в корнях трансгенных растений. За счет экспрессии гена металлотионеина SaMT2, трансгенные растения показали более высокую активность антиоксидантных ферментов и аккумулировали меньше H 2 O 2 , чем растения WT при обработке Cd и Zn. Следовательно, SaMT2 может значительно повысить толерантность и накопление Cd и Zn в трансгенных растениях табака за счет хелатирования металлов и улучшения антиоксидантной системы.

Регулятор числа клеток 2 (TaCNR2) из ​​мягкой пшеницы ( Triticum aestivum ) подобен растительным белкам устойчивости к Cd, участвующим в регуляции транслокации ТМ. Чтобы понять влияние TaCNR2 на переносимость и транслокацию HM, K. Qiao et al. (2019) сверхэкспрессировали ген TaCNR2 у арабидопсиса и риса. Количественная ПЦР в реальном времени показала, что экспрессия TaCNR2 в проростках пшеницы увеличивалась при обработке Cd, Zn и Mn. Сверхэкспрессия TaCNR2 у арабидопсисаи рис повышал их устойчивость к Cd, Zn и Mn, а сверхэкспрессия в рисе улучшала транслокацию Cd, Zn и Mn от корней к побегам. Результаты показали, что TaCNR2 может транспортировать ионы ТМ. Таким образом, это исследование обеспечивает новый генный ресурс для увеличения поглощения питательных веществ и снижения накопления токсичных металлов в сельскохозяйственных культурах [ 75 ].

Другой стратегией повышения эффективности фитоэкстракции является сверхэкспрессия фитохелатинов (PC). Фитохелатины играют важную роль в детоксикации и толерантности к ТМ в растениях [ 76 ]. Синтез ПК катализируется фитохелатинсинтазой (ФХС), которая активируется ТМ [ 77 ]. Чжу и др. (2021) выделили ген PCS, BnPCS1 , из лубяных волокон (определяемых как волокна, полученные из наружных клеточных слоев стеблей различных растений) рами ( Boehmeria nivea ) с использованием метода RACE (быстрая амплификация концов кДНК). . BnPCS1 _промоторная область содержит несколько цис-действующих элементов, участвующих в реакциях на фитогормоны или абиотические стрессы. Анализ субклеточной локализации свидетельствует о том, что белок BnPCS1 - GFP локализуется в ядре и цитоплазме. Анализы ПЦР в реальном времени показали, что экспрессия BnPCS1 в значительной степени индуцируется Cd и растительным гормоном абсцизовой кислотой (ABA). Трансгенные линии со сверхэкспрессией гена BnPCS1 демонстрировали лучший рост корней и сырую массу, более низкие уровни MDA и H 2 O 2 , а также более высокое накопление и транслокацию Cd по сравнению с WT при стрессе Cd. В совокупности эти результаты могут предоставить новые генетические ресурсы для фитоэкстракции почв, загрязненных Cd.78 ].

3.2.2. Сверхэкспрессия ферментов

Кумар и др. (2019) получили трансгенные растения люцерны ( Medicago sativa L.), которые сверхэкспрессировали ген АТФ-сульфурилазы Arabidopsis с помощью генетической трансформации , опосредованной Agrobacterium . Отобранные трансгенные линии показали повышенную толерантность к смеси пяти ТМ (Pb, Cd, Cu, Ni и V), а также продемонстрировали повышенную способность к поглощению металлов в контролируемых условиях. Трансгенные линии были фертильны и не проявляли каких-либо явных морфологических аномалий. Результаты этого исследования показали эффективный подход к улучшению способности растений люцерны к накоплению ТМ, который затем можно использовать для восстановления загрязненных металлами почв в засушливых регионах [ 79 ].

Аскорбатпероксидаза (APX) играет важную роль в метаболизме окислительного стресса у высших растений [ 80 ]. Сюй и др. (2008) проанализировали роль APX в защите от чрезмерного Zn-индуцированного окислительного стресса в трансгенных растениях Arabidopsis , конститутивно сверхэкспрессирующих ген пероксисомной аскорбатпероксидазы ( HvAPX1 ) из ячменя. Они обнаружили, что трансгенные растения более устойчивы к цинковому стрессу, чем растения WT . При стрессе Zn концентрации накопления перекиси водорода и малонового диальдегида (МДА) были выше у WT.растений, чем у трансгенных растений. Таким образом, механизм толерантности к Zn у трансгенных растений может быть связан с уменьшением повреждений, вызванных окислительным стрессом. В условиях цинкового стресса активность АРХ была значительно выше у трансгенных растений, чем у растений дикого типа . Авторы также обнаружили, что накопление Zn в побегах было намного выше у трансгенных растений, чем у WT при Zn-стрессе. Кроме того, трансгенные растения были более устойчивы к чрезмерному стрессу Cd и накапливали больше Cd в побегах, чем WT . Эти результаты предполагают, что HvAPX1 играет важную роль в толерантности к Zn и Cd и может быть геном-кандидатом для разработки растений с высокой устойчивостью к биомассе для фитоэкстракции Zn и Cd в загрязненной металлами среде [ 81 ].

4. Новые стратегии фитоэкстракции

4.1. Биоассистированная фитоэкстракция

Фиторемедиация с помощью микробов является многообещающей стратегией гипераккумуляции, детоксикации или восстановления загрязнителей почвы. Арбускулярные микоризные грибы (AMF) встречаются почти на всех растениях, способствуя здоровой продуктивности и обеспечивая устойчивость к стрессовым факторам окружающей среды. AMF колонизируют корни растений и распространяют их гифы в область ризосферы, способствуя поглощению минеральных питательных веществ и регуляции приобретения ТМ, а также усилению роста за счет поглощения питательных веществ, детоксикации МН, регуляции вторичных метаболитов и повышении устойчивости к абиотическим/биотическим стрессам. 82 ].

Сан и др. (2017) изучали различные условия биоремедиации почвы, загрязненной свинцом, с использованием Solanum nigrum L. в сочетании с Mucor circinelloides . Они заметили, что по сравнению с контролем эффективность удаления Pb была оптимальной при стратегии микробной/фиторемедиации по сравнению с только фиторемедиацией, которая, в свою очередь, была лучшим подходом, чем микробная ремедиация. Показатели биоремедиации составили 58,6, 47,2 и 40,2% в группах микробной/фиторемедиации, микробной ремедиации и фиторемедиации соответственно. Инокуляция почвы M. circinelloides усиливает удаление Pb и S. nigrum.Л. рост. Кроме того, плодородие почвы увеличилось после биоремедиации в соответствии с изменением ферментативной активности. Результаты показали, что инокуляция S. nigrum L. M. circinelloides повышает ее эффективность для фиторемедиации почвы, загрязненной Pb [ 83 ].

Другим примером фитоэкстракции с помощью арбускулярных микоризных грибов является исследование, проведенное Singh et al. (2019). В этом исследовании арбускулярные микоризные грибы (AMF) использовались для стимуляции роста Zea mays L. в богатом ТМ шламе кожевенного завода (HMRTS). Для определения подходящих видов AMF был проведен эксперимент в горшке с использованием Rhizophagus fasciculatus , Rhizophagus intraradices , Funneliformis mosseae и Glomus aggregatum для культивирования Zea mays L. в условиях HMRTS. Обработки AMF значительно повлияли на рост растений и потенциал фиторемедиации. Интересно, что F. mosseaeдействует как биофильтр в корнях и модулирует прямую транслокацию ТМ (Cd, Cr, Ni, Pb) и микроэлементов из почвы в побеги (фактор биоаккумуляции), а также из корней в побеги (фактор транслокации) в растениях. В HMRTS также было обнаружено, что инокуляция AMF значительно улучшает ферментативную активность почвенных микробов, таких как дегидрогеназа, β-глюкозидаза, кислая и щелочная фосфатаза. Результаты этого исследования показывают, что культивирование Zea mays с помощью AMF является многообещающим подходом для фиторемедиации HMRTS [ 84 ].

Большое внимание уделяется применению полезных почвенных микробов. Эль-Исави и др. (2020) исследовали роль Serratia marcescens BM1 в повышении устойчивости растений сои к кадмийному стрессу и потенциала фитоэкстракции. Инокуляция растений сои, подвергнутых стрессу Cd, с помощью Serratia marcescens BM1 значительно улучшала рост растений, биомассу, газообмен, поглощение питательных веществ, антиоксидантную способность, содержание хлорофилла, общее количество фенолов, флавоноидов, растворимых сахаров и белков. Кроме того, Serratia marcescensИнокуляция BM1 снижала уровни маркеров Cd и окислительного стресса, но значительно индуцировала активность антиоксидантных ферментов, уровни осмолитов и экспрессию генов, связанных со стрессом, у растений, подвергшихся стрессу Cd. Кроме того, применение 300 мкМ CdCl 2 и Serratia marcescens вызывало самые высокие уровни экспрессии генов, связанных со стрессом. В целом, это исследование показало, что инокуляция растений сои Serratia marcescens BM1 способствует фитоэкстракционному потенциалу и устойчивости к стрессу Cd путем модулирования фотосинтетических свойств, биосинтеза осмолитов, механизма антиоксидантов и экспрессии генов, связанных со стрессом [ 85 ].

Микробная фитоэкстракция использовалась для усиления гипераккумуляции, детоксикации и устранения загрязнений почвы. Было доказано, что использование либо арбускулярных микоризных грибов (AMF), либо бактерий полезно для растений, способствуя поглощению минеральных питательных веществ, регулированию приобретения ТМ, росту и корневой системе, а также устойчивости к абиотическим/биотическим стрессам. В целом фитоэкстракция с помощью микробов является подходящей стратегией для улучшения технологии фиторемедиации, но она имеет некоторые ограничения с точки зрения уровня загрязнения, который может быть успешно применен.

4.2. Эпигенетическая регуляция

В последние годы в нескольких исследованиях были выяснены различные пути передачи сигнала, участвующие в реакциях HM, идентифицированы дополнительные генетические механизмы, обеспечивающие толерантность к растениям [ 86 ]. Регуляция HM-чувствительных генов была связана с эпигенетическими механизмами, такими как метилирование ДНК и модификации гистонов, которые могут подавлять или активировать экспрессию генов посредством модификации ДНК, а также путем предотвращения перемещения транспозонов. Было продемонстрировано, что гиперметилирование ДНК генома участвует в ответной реакции ТМ на стресс, защищая ДНК от возможных повреждений, вызванных металлическими субпродуктами [ 87 ].

Среди цитотоксических ионов трехвалентный катион алюминия (Al +3 ), образующийся при солюбилизации алюминия (Al) в кислых почвах, является одним из наиболее распространенных и токсичных элементов в кислых условиях. Конкретные гены, связанные с толерантностью к Al, измеренные в контрастных устойчивых и восприимчивых сортах риса, показали различия в частоте метилирования ДНК. Дифференциальные паттерны метилирования могут быть связаны с эпигенетической регуляцией реакции риса на стресс Al, подчеркивая основную роль эпигенетики по сравнению со специфическими реакциями на абиотический стресс [ 86 , 88 ].

Фэн и др. (2016) изучали изменение паттернов метилирования ДНК, связанное с экспрессией генов, у риса ( Oryza sativa ), подвергшегося воздействию кадмия. Они сообщили о полногеномных картах разрешения с одним основанием метилированного цитозина и изменений транскриптома в рисе, подвергнутом воздействию Cd [ 89 ].]. Были выявлены широко распространенные различия в метках метилирования CG и не-CG между геномами риса с Cd и без Cd. Было обнаружено больше гиперметилированных, чем гипометилированных генов, и многие гены были вовлечены в реакцию на стресс, транспорт металлов и факторы транскрипции. Большинство генов с модифицированным метилированием ДНК были транскрипционно изменены при стрессе Cd. Исследование Niedziela (2018) показало аналогичные результаты. Жидкостная хроматография (ОФ-ВЭЖХ), анализ полиморфизмов длины амплифицированных фрагментов метилирования (metAFLP) и анализ полиморфизмов амплификации, чувствительных к метилированию (MSAP), использовались для исследования влияния стресса алюминия (Al) на уровни метилирования ДНК в культурах видов тритикале. ОФ-ВЭЖХ, но не metAFLP или MSAP, выявила значительные различия в метилировании между Al-толерантными (T) и нетолерантными (NT) линиями тритикале. Направление изменения метилирования зависело от фенотипа и органа растения. Обработка Al увеличивала уровень глобального метилирования ДНК в корнях Т-линий примерно на 0,6%, тогда как деметилирование примерно на 1,0% наблюдалось в NT-линиях. На метилирование ДНК в листьях Al стресс не влиял. Подходы metAFLP и MSAP идентифицировали изменения ДНК, вызванные Al.3+ лечение [ 90 ].

Другим примером эпигенетической регуляции является процесс убиквитинирования. Убиквитин (Ub)-удлиняющий белок (UBQ) функционирует как убиквитиновый донор в протеасомной системе Ub/26S, которая активно участвует в деградации белков-мишеней и, таким образом, участвует в широком спектре физиологических реакций [ 91 , 92 ]. Зависимая от убиквитинирования деградация белка участвует в росте, развитии и взаимодействии с окружающей средой растений, но функции генов убиквитин-лигазы (Е3) в основном неизвестны у томатов ( Solanum lycopersicum L.). Точно так же Ахамед и соавт. (2020) функционально охарактеризовали ген лигазы RING E3, SlRING1 , который позитивно регулирует толерантность к Cd у растений томатов. Эксперимент по убиквитинированию in vitro показал, что SlRING1обладает активностью убиквитинлигазы E3. Определение субклеточной локализации показало, что SlRING1 располагается в плазматической мембране и ядре. Сверхэкспрессия SlRING1 в томатах увеличивала содержание хлорофилла, чистую скорость фотосинтеза и максимальную фотохимическую эффективность фотосистемы II (Fv/Fm), но снижала уровни активных форм кислорода и относительную утечку электролита при стрессе Cd. Кроме того, сверхэкспрессия SlRING1 увеличивала уровни транскриптов каталазы (CAT), дегидроаскорбатредуктазы (DHAR), монодегидроаскорбатредуктазы (MDHAR), глутатиона (GSH1) и фитохелатинсинтазы (PCS), что способствовало антиоксидантному и детоксикационному ответу. Важно отметить, что SIRING1сверхэкспрессия также снижала концентрацию Cd как в побегах, так и в корнях. Таким образом, повышенная толерантность к Cd из-за индуцированной сверхэкспрессии SlRING1 объясняется снижением накопления Cd и облегчением окислительного стресса. Эти данные свидетельствуют о том, что SlRING1 является положительным регулятором толерантности к Cd, что может быть потенциальной мишенью селекции для улучшения толерантности к HM у растений [ 93 ].

4.3. Стекирование генов

Гуо и др. (2008) изучали развитие трансгенных растений с повышенной толерантностью и накоплением ТМ путем одновременной сверхэкспрессии AsPCS1 и GSH1 (полученных из чеснока и пекарских дрожжей) в A. thaliana . Фитохелатины (PCs) и глутатион (GSH) являются основными связывающими пептидами, участвующими в хелатировании ионов ТМ в растениях и других живых организмах [ 67 , 76 , 94 ]. Одногенные трансгенные линии имели более высокую толерантность к Cd и As и накапливали больше Cd и As, чем WT .. По сравнению с одногенными трансгенными линиями двухгенные трансформанты проявляли значительно более высокую устойчивость к Cd и As и накапливали больше Cd и As. Одна из двухгенных трансгенных линий, PG1, накапливала в два раза больше Cd, чем одногенные трансгенные линии. Одновременная сверхэкспрессия AsPCS1 и GSH1 приводила к повышенной общей продукции PC в трансгенных растениях Arabidopsis . Результаты показывают, что наложение модифицированных генов повышает толерантность и накопление Cd и As в трансгенных линиях и представляет собой многообещающий новый инструмент для использования в усилиях по восстановлению растений.

Аналогичные результаты были получены, когда Zhao et al. (2014) выделили ген, кодирующий PC-синтазу ( PaPCS ), и проверили ее функцию посредством гетерологичной экспрессии в штамме дрожжей, чувствительном к Cd. Впоследствии вид Festuca arundinacea , чувствительный к Cd и способный накапливать биомассу, трансформировали либо с помощью PaPCS , либо PaGCS (ген глутамилцистеинсинтетазы Phragmites australis ) по отдельности (отдельные трансформанты) или с помощью обоих генов вместе в одной и той же трансгенной кассете. (двойной трансформант). Одинарные и двойные трансформанты проявляли большую толерантность к Cd и накапливали больше Cd и PC, чем растения дикого типа , а их соотношение листьев и корней Cd было выше. Таким образом, ПаГКСпо-видимому, оказывает большее влияние, чем PaPCS, на синтез PC, устойчивость и накопление Cd. Двойной трансформант обладает интересным потенциалом для фитоэкстракции [ 77 ].

Другим примером является шелковица ( Morus L.), один из наиболее важных с экологической и экономической точки зрения родов деревьев, который может восстанавливать почвы, загрязненные тяжелыми металлами. Фан и др. (2018) идентифицировали два гена PCS Morus notabilis на основе полногеномного анализа базы данных генома Morus . Количественный анализ полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) показал, что при стрессе 200 мкМ Zn 2+ или стрессе 30 или 100 мкМ Cd 2+ индуцируется относительная экспрессия каждого из двух MaPCS (из Morus alba ) . в тканях корня, стебля и листа в течение 24 часов после воздействия металлов, при этом Cd2+ индуцирует экспрессию сильнее, чем Zn2+ сверхэкспрессия MnPCS1 и MnPCS2 в арабидопсисе и табаке повышала толерантность к Zn 2+ /Cd 2+ у большинства трансгенных индивидуумов. Результаты трансгенных линий Arabidopsis со сверхэкспрессией MnPCS1 и MnPCS2 позволяют предположить, что MnPCS1 играет более важную роль в детоксикации Cd, чем MnPCS2 . Кроме того, наблюдалась положительная корреляция между накоплением Zn и уровнем экспрессии MnPCS1 или MnPCS2 . Результаты показали, что Morus PCS1 и PCS2гены играют важную роль в стрессоустойчивости и накоплении ТМ, обеспечивая полезный генетический ресурс для повышения устойчивости к ТМ и увеличения потенциала фитоэкстракции ТМ этих растений [ 95 ].

LeDuc (2004) изучал сверхэкспрессию селеноцистеинметилтрансферазы (SMT) у арабидопсиса и индийской горчицы для повышения толерантности и накопления селена (Se). SMT детоксифицирует селеноцистеин, метилируя его в метилселеноцистеин, небелковую аминокислоту, тем самым уменьшая токсическое неправильное включение Se в белок. Авторы использовали генную инженерию для создания быстрорастущих растений с повышенной способностью переносить, накапливать и испарять Se путем включения гена, кодирующего селеноцистеин-метилтрансферазу из гипераккумулятора Se Astragalus bisulcatus , в индийскую горчицу. Полученные в результате трансгенные растения успешно улучшили фитоэкстракцию Se за счет того, что переносили и накапливали Se значительно лучше, чем WT .растения. Чтобы усилить фитоэкстракцию селената, LeDuc (2004) разработал двойные трансгенные растения, которые сверхэкспрессировали ген, кодирующий АТФ-сульфурилазу (APS), в дополнение к SMT. Результаты показали существенное улучшение накопления Se из селената (увеличение в 4-9 раз) в трансгенных растениях со сверхэкспрессией как APS, так и SMT [ 96 ].

4.4. Редактирование генов и генная инженерия

В последние годы был разработан инновационный метод редактирования генов, называемый системой CRISPR-Cas9. Этот метод обычно используется для экспериментов по нокауту генов и для редактирования геномов различных культурных растений [ 97 ]. Он состоит из нуклеазы Cas9, которая создает двухцепочечный разрыв ДНК (DSB), и направляющей РНК (гРНК), которая отвечает за направление нуклеазы в определенную область генома. Эндогенные механизмы репарации клеток могут привести к делеции генов. Генная инженерия может использовать важные гены, идентифицированные с помощью транскриптомики, для создания идеальных растений-гипераккумуляторов. Включение передовых технологий, таких как CRISPR-Cas9 и синтетические гены, поможет улучшить технологию фитоэкстракции [ 98 ].]. Более того, Танг и соавт. (2017) продемонстрировали способность CRISPR уменьшать накопление Cd в рисе путем отключения гена переносчика металла OsNramp5 . На сегодняшний день это, пожалуй, самый значительный прогресс CRISPR в области фитоэкстракции, который подчеркивает перспективность его использования для регуляции транскрипции генов [ 99 ].

Тем не менее, областью исследований CRISPR, которая может иметь еще больший потенциал для улучшения фитоэкстракции, является использование dCas9, управляемого гРНК, для модуляции экспрессии генов. Факторы транскрипции могут быть слиты с dCas9 для подавления или усиления транскрипции с помощью РНК-полимеразы и последующего повышения или понижения экспрессии интересующего гена или группы генов [ 100 ].]. Система CRISPR-Cas9 была адаптирована для создания технологии под названием CRISPRa (активация CRISPR). CRISPRa использует инактивированную нуклеазу Cas9 (dCas9), которая не может вызвать разрыв двухцепочечной ДНК в целевых областях генома, что приводит к РНК-направленному контролю транскрипции. Cas9 может быть слит с различными доменами активации транскрипции, которые могут быть нацелены на промоторные области с помощью направляющей РНК (gRNA), которая рекрутирует дополнительные домены активации транскрипции для усиления экспрессии гена-мишени [ 101 ]. Используя систему CRISPRa, каталитически мертвый dCas9, слитый с пептидом-активатором транскрипции, может увеличить транскрипцию определенного гена посредством сконструированной последовательности гРНК для направления активатора dCas9 к промоторной или регуляторной областям интересующего гена [ 102 ]., 103 ].

Редактирование генов с использованием новейших методов, таких как CRISPR-Cas, может повысить естественную способность растения расти, накапливать и переносить ТМ, хотя это не считается трансгенным подходом. CRISPR-Cas9 кажется более многообещающим методом модификации экспрессии генов без введения чужеродных генов. Принимая все это во внимание, можно использовать модификацию экспрессии генов, метаболических путей и сетей гомеостаза загрязнителей, которые поддерживают гипераккумуляцию, толерантность или деградацию, для повышения эффективности поглощения ТМ растениями, избегая при этом токсичности металлов. Поэтому редактирование генов и генная инженерия считаются подходящей стратегией для улучшения процесса фитоэкстракции.

4.5. Использование местных растений в качестве модели исследования

Стандартный подход к преодолению ограничений технологии фитоэкстракции заключается в использовании генов, характерных для толерантных или гипераккумуляторных экзотических растений, в модельных (традиционных) видах с высокими темпами роста и значительным производством воздушной биомассы. Однако использование инвазивных неместных видов может повлиять на биоразнообразие [ 104 ]. Некоторые из этих видов растений могут вторгаться в окружающие природные территории, тем самым вызывая нарушение и изменение функций экосистем, снижая местное биоразнообразие и негативно влияя на местную экономику и благополучие людей [ 105 ].

Более подходящим решением для повышения эффективности фитоэкстракции in situ может быть использование местных растений, которые уже акклиматизированы к абиотическому стрессу, вызываемому ТМ в почве. Выбор подходящих видов растений является важным шагом в правильном применении любых фитотехнологий in situ (например, фитоэкстракция, фитостабилизация и фитодобыча). Следовательно, использование и модификация местных или эндемичных растений, произрастающих на загрязненных участках, может быть лучшей стратегией повышения эффективности фиторемедиации.

Кроме того, местные растения, естественным образом колонизирующие участки, загрязненные металлами, являются важным источником устойчивых к металлам микроорганизмов, которые можно использовать в биологической фиторемедиации. Водный папоротник Azolla filiculoides Lam. ( Salviniaceae ) является эффективным гипераккумулятором металлов , обладающим эндофитным микробиомом с потенциалом PGPB [ 106 ] .

В зависимости от конкретных условий (например, климата) богатые металлами почвы могут сосуществовать с дополнительными одновременно возникающими стрессорами, такими как засуха и засоление, которые могут еще больше ограничить фитоэкстракцию [ 107 ]. В этих случаях может иметь место сочетание двух или более абиотических стрессоров, приводящее к новым условиям развития растений, отличным от действия каждого стрессора в отдельности [ 108 , 109 ]. Таким образом, отбор растений для фитоэкстракции должен также учитывать наличие множественных сопутствующих стрессоров и их влияние на рост и развитие растений [ 110 ].]. Заброшенные хвостохранилища представляют собой глобальную проблему: тысячи открытых хвостохранилищ без растительности представляют собой источник загрязнения для близлежащих населенных пунктов. Хвостохранилища в засушливых и полузасушливых районах особенно подвержены ветровому рассеиванию и водной эрозии [ 111 , 112 , 113 ]. Установлению видов растений на хвостохранилищах в засушливых и полузасушливых регионах препятствуют физико-химические факторы, в том числе экстремальные температуры, малое количество осадков, сильные ветры, низкое содержание питательных веществ и высокие концентрации солей [ 113 ], среди прочего, что представляет собой ряд сопутствующих растений. стрессоры. Лам и др. (2017) выбрали три местных вида растений: Prosopis tamarugo , Schinus molle.и Atriplex nummularia для использования в изучении потенциала фиторемедиации местных растений, произрастающих на хвостохранилище медного рудника в северной части Чили. Растения были выбраны из-за их естественного присутствия в северной части Чили и их способности расти на участках с характеристиками, сходными с характеристиками рассматриваемого хвостохранилища [ 114 ]. Дополнительные примеры этого исследования комбинированных стрессоров, влияющих на продуктивность растений, включают исследования Orrego (2020), в которых оценивалось влияние одиночного и комбинированного стресса Cu, NaCl и водного стресса на параметры роста трех видов Atriplex с фитостабилизирующим потенциалом: Atriplex atacamensis , A .halimus и A. nummularia . Атриплексвиды характерны для сухих и засоленных почв. Это исследование показало, что виды Atriplex по-разному страдают от соли, засухи и металлического стресса, и что комбинированный стресс оказывает общее негативное влияние на параметры роста [ 115 ].

Существует множество исследований, направленных на поиск и идентификацию толерантных к металлам растений, т. е. экотипов металлофитов и гипераккумуляторов, произрастающих на загрязненных участках, таких как промышленные и сельскохозяйственные почвы с повышенными концентрациями металлов [ 116 ]. В Латинской Америке металлические руды многочисленны и разнообразны. Из-за богатых месторождений полезных ископаемых, загрязненных территорий, погодных условий и уникального растительного разнообразия в этом регионе, вероятно, будут обнаружены толерантные к металлам и гипераккумуляторные растения (металлофиты) [ 117 ]. Однако, поскольку научных исследований металлофитов в Бразилии, Кубе, Доминиканской Республике, Венесуэле, Аргентине, Парагвае и Чили было мало, в Латинской Америке было зарегистрировано несколько растений, толерантных к металлам, и растений-гипераккумуляторов металлов по сравнению с другими районами мира. [117 , 118 , 119 ]. На сегодняшний день 172 вида растений были описаны либо как устойчивые к металлам (30 видов), либо как гипераккумуляторы (142 вида), что является небольшим числом по сравнению с большим разнообразием видов растений в регионе [ 120 ]. Недавно была оценена способность к накоплению ртути (Hg) у трех видов растений ( Axonopus Compressus , Erato polymnioides и Miconia zamorensis) , которые растут на почвах, загрязненных кустарными небольшими золотыми приисками в тропических лесах Эквадора. Исследователи обнаружили взаимодействие консорциумов между арбускулярными микоризными грибами (AMF) и этими видами растений. Например, E. polymnioidesповышенное накопление Hg при выращивании с большей колонизацией AMF [ 121 ].

Отходы сахарного тростниково-меласного спиртового завода (шлам) содержат не только смесь сложных органических загрязнителей, но и большое количество Fe (5264,49), Zn (43,47), Cu (847,46), Mn (238,47), Ni (15,60) и Pb. ( 31,22 мг/кг ), что повышает его токсичность для окружающей среды. Чандра и Кумар (2017) оценили схему фитоэкстракции 15 местных растений, растущих в постметанированном спиртовом иле (PMDS). Исследователи изучили потенциал фитоэкстракции местных сорняков и трав. Это исследование показало, что из отобранных растений Blumea lacera , Parthenium hysterophorous , Setaria viridis , Chenopodium album , Cannabis sativa , Basella alba ,Корневыми аккумуляторами Fe, Zn и Mn были Tricosanthes dioica , Amaranthus spinosus L., Achyranthes sp., Dhatura stramonium , Sacchrum munja и Croton bonplandianum . S. munja , P. hysterophorous , C. sativa , C. album , T. dioica , D. stramonium , B. lacera , B. alba , Kalanchoe pinnata и Achyranthes sp. оказались аккумуляторами для Fe. Кроме того, A. spinosusL. оказался побеговым аккумулятором Zn и Mn. Эти результаты свидетельствовали о высокой аккумуляционной и транслокационной способности этих растений. Кроме того, ультраструктурные наблюдения тканей корня выявили отложения ТМ в различных клеточных компонентах без каких-либо явных токсических эффектов [ 122 , 123 ]. Следовательно, эти местные растения могут быть использованы в качестве инструмента для фиторемедиации на месте и эковосстановления участков, загрязненных промышленными отходами.

Другим примером местного вида-гипераккумулятора является многолетнее растение Phytolacca acinosa Roxb. ( Phytolaccaceae ), который встречается на юге Китая. Полевые исследования почв, богатых марганцем, и эксперименты в теплицах показали, что это растение является гипераккумулятором марганца. Этот вид не только обладает замечательной устойчивостью к марганцу, но также обладает исключительной способностью поглощать и накапливать этот элемент. Эти результаты подтверждают, что P. acinosa является гипераккумулятором Mn, который быстро растет и имеет значительную биомассу, широкое распространение и широкую экологическую амплитуду. Этот вид представляет собой новый растительный ресурс для изучения механизма гипераккумуляции марганца и имеет потенциал для использования в фиторемедиации почв, загрязненных марганцем [ 124 ].

В другом исследовании, проведенном Амером (2013), были показаны три эндемичных средиземноморских вида растений, Atriplex halimus , Portulaca oleracea и Medicago lupulina , которые были выращены на гидропонике для оценки их потенциального использования в фиторемедиации и производстве биомассы. Atriplex halimus и M. lupulina продуцировали высокую биомассу побегов при относительно низкой транслокации металлов в надземные части растений. Эффективность поглощения металлов растениями ранжируется следующим образом: A. halimus более эффективен, чем M. lupulina , а последний более эффективен, чем P. oleracea. Из-за высокой продуктивности биомассы и относительно высокого содержания металлов в корнях A. halimus иM. lupulina может быть успешно использована для фиторемедиации и особенно для фитостабилизации [ 125 ].

Ке и др. (2007) изучили две популяции Rumex japonicus , одну из медного рудника, а другую из незагрязненного участка. Исследователи провели эксперименты по выращиванию в условиях гидропоники, чтобы оценить накопление меди и содержание минеральных питательных веществ в условиях избытка меди и дефицита питательных веществ [ 126].]. Показатели толерантности загрязненной популяции были значительно выше, чем у незагрязненной популяции, что указывает на эволюцию толерантности к Cu в загрязненной популяции. При контрольных уровнях и низких уровнях обработки Cu не было различий в накоплении Cu в корнях двух популяций. Однако при обработке высоким содержанием меди (100 мкМ) загрязненная популяция накапливала меньше меди в корнях, чем незагрязненная, что указывает на механизмы исключения корней у акклиматизированных растений. Растения со стратегиями исключения в настоящее время используются для восстановления растительности на голых участках почвы с высокой концентрацией металлов; растения с аккумулятивной стратегией используются для фитоэкстракции почв с высоким содержанием металлов [ 127 ]. Румекс японскийрастения из кучи медного рудника используют стратегию исключения и потенциально могут быть использованы для восстановления растительности на участках почвы, загрязненных медью. По сравнению с растениями на незагрязненных участках, растения R. japonicus , растущие на участке рудника, загрязненном медью, демонстрировали более высокие темпы роста, толерантность к меди и толерантность к дефициту минеральных питательных веществ. Кроме того, их минеральный состав меньше подвергался воздействию медного стресса, что свидетельствует о том, что стабильность и гомеостаз минерального состава при стрессе дефицита питательных веществ играют важную роль в толерантности растений к меди [ 126 ].

Полипогон австралийский Бронг. (Poaceae) — местная трава Чили, которая спонтанно колонизирует заброшенные хвостохранилища медных рудников и накапливает медь в листьях и корнях на уровнях, считающихся фитотоксичными для других видов растений [ 128 ]. Ortiz-Calderón (2008) обнаружил, что Polypogon australis , растущий на хвостохранилищах, содержит 670 и 223 мг/кг Cu (сухое вещество) в листьях и корнях соответственно. Общее содержание меди в тканях растений составляло 892,5 мг/кг ( сухой вес), а отношение содержания меди в листьях к корням равнялось 3,0, что свидетельствует о переносе меди из корней в листья [ 129 ]. Хара-Эрмосилья и др. (2017) охарактеризовали состояние H 2 O 2- снижение активности ферментов у факультативных видов металлофитов Polypogon australis при обработке жидкими отходами горнодобывающей промышленности (MLW), полученными из медного рудника. Чтобы определить влияние растворимости металлов, присутствующих в MLW, исследователи изучили накопление элементов, вариации уровней H 2 O 2 и липопероксидации, а также взаимосвязь этих параметров с активностью восстановления H 2 O 2 у P. australis . растения при pH 5,1 (кислая MLW) ​​и pH 6,7 (нейтральная MLW) ​​в течение двух недель. Результаты показали, что содержание металлов в MLW, а не растворимость металлов, вызывало увеличение содержания H 2 O 2содержания в тканях растений и запускал ферментативный контроль H 2 O 2 [ 130 ]. Нони-Моралес и др. (2019) оценили способность P. australis прорастать и расти в почве, загрязненной дизельным топливом. Растения Polypogon australis , прорастающие и растущие в почвах, загрязненных дизельным топливом, проявляли высокую устойчивость и выживаемость по сравнению с другими устойчивыми к дизельному топливу видами. Расчетная эффективная концентрация (EC 50 ) дизельного топлива для P. australis составила 4,5%. Polypogon australis прорастал и рос при всех концентрациях дизельного топлива, использованных в экспериментах. Вид был классифицирован как устойчивый к дизельному топливу [ 131 ].

Металлоустойчивые растения и другие устойчивые к стрессу растения хорошо представлены в семействе Poaceae [ 132 ]. Шалмани и др. (2019) изучали белки B-box (BBX), которые играют важную роль в регуляции роста и развития растений, влияя на фотоморфогенез, фотопериодическую регуляцию цветения и реакцию на биотический и абиотический стресс [ 133 ].]. Эти исследователи извлекли в общей сложности 131 члена BBX из пяти видов Poaceae, в том числе 36 из кукурузы, 30 из риса, 24 из сорго, 22 из костра жесткого и 19 из проса. Они наблюдали изменения в паттернах экспрессии членов BBX в ответ на абиотический, гормональный и HM стресс, показывая потенциальную роль белка B-box в росте и развитии растений и в ответ на многовариантные стрессы. Полученные данные свидетельствуют о том, что гены BBX можно использовать в качестве потенциальных генетических маркеров для растений, особенно в функциональном анализе и при многовариантных стрессорах. Эзаки и др. (2013) создали модель толерантности к Al у Andropogon virginicus (Poaceae). В совокупности их результаты показали, что A. virginicusпоказали высокую толерантность к Al при сочетании пяти независимых подходов: (1) подавление поглощения Al корнями из почвы; (2) высокий транспорт алюминия от корня к побегу; (3) накопление и секреция Al в листьях; (4) индукция антиперекисных ферментов и полифенолов алюминием; и (5) индуцированная алюминием продукция NO в корнях [ 134 ].

Использование местных растений имеет свои преимущества и недостатки. С точки зрения преимуществ, местные растения уже адаптированы к стрессовым факторам окружающей среды благодаря естественному отбору и эволюции и устойчивы к множеству стрессовых факторов на участке. Кроме того, некоторые металлофиты являются травянистыми растениями, которые поэтому имеют высокую скорость роста. Однако основным недостатком использования местных растений является то, что они имеют неизвестные геномы, и для них должны быть определены протоколы трансформации и регенерации in vitro.

5. Правовые и нормативные ограничения

Редактирование генома заключается в создании направленных, постоянных и наследственных мутаций в определенном месте генома, опосредованных системами репарации ДНК в клетке, с наименьшей вероятностью совершения нежелательных ошибок (нецелевых) и отсутствием чужеродных последовательностей ДНК. Новые технологии селекции растений (NPBT), такие как пальцевые нуклеазы Zn (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), кластеризованные короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами, связанные с эндонуклеазой Cas9 (CRISPR-Cas9), олигонаправленный мутагенез (ODM) , цисгенез, РНК-направленное метилирование ДНК (RdDM), прививка, обратное размножение и агроинфильтрация использовались для индукции специфических мутаций в геноме, привнесения полезных признаков или для экспрессии трансгенов в специфической ткани в широком диапазоне сельскохозяйственных культур и растений. модели растений [ 100, 135 ].

Технологии редактирования генов, такие как CRISPR-Cas9, открывают большие перспективы для развития науки и прикладных технологий. Эта основополагающая технология позволяет модифицировать генетическую структуру любого живого организма с беспрецедентной точностью [ 136 ]. Недавнее развитие и масштабы системы CRISPR-Cas поставили перед регуляторами новые проблемы во всем мире из-за моральных, этических, безопасности и технических проблем, связанных с ее применением в доклинических и клинических исследованиях, биомедицине и сельском хозяйстве [ 137 ].]. Однако для того, чтобы увеличить его потенциал для общественной пользы, необходимо принять правила и адекватные положения. Это требует междисциплинарных усилий в юридическом мышлении. Любая законодательная инициатива должна учитывать как преимущества, так и этические аспекты редактирования генов с широкой социальной и ценностной точки зрения [ 136 ].

В разных странах действуют разные правила утверждения и выращивания сельскохозяйственных культур, разработанных с использованием NPBT, таких как редактирование генов [ 138 ]. Технологии селекции растений расширились, ускорив селекционные исследования, выходящие за рамки действующих правил. Применение редактирования генома, такого как CRISPR-Cas9, не совсем вписывается в существующие нормативные рамки, что создает неопределенность в отношении того, можно ли их использовать в качестве традиционно выведенных разновидностей без дальнейшего регулирования [ 139 ]. В целом анализ фокусируется на том, произошла ли «новая комбинация» генетического материала. Это определяется как «стабильная вставка одного или нескольких генов или последовательностей ДНК, кодирующих белки, интерферирующие РНК, двухцепочечные РНК, сигнальные пептиды или регуляторные последовательности» [ 140 ].].

В Чили процедуры импорта, внутреннего размножения и реэкспорта размножаемого генетически модифицированного (ГМ) растительного материала в стране были установлены Резолюцией о степени 1523/2001. Служба сельского хозяйства и животноводства (SAG) Чили устанавливает стандарты для интернирования и введения в окружающую среду живых модифицированных растительных организмов для размножения в соответствии с Резолюцией 1523/2001. Это ключевой критерий, определяющий, будет ли организм рассматриваться как генетически модифицированный организм (ГМО) и должна ли Резолюция 1523/2001 применяться к новым материалам, полученным из NPBT. В этой резолюции ГМО определяется как «живой биологический организм, способный передавать или воспроизводить генетический материал, включая стерильный организм, вирусы, и вироиды, обладающие новой комбинацией генетического материала, полученного с применением современных биотехнологий». Эта нормативно-правовая база разрешает производство ГМ-семян исключительно для экспорта и исследований и разработок; сохранение и коммерциализация ГМ-семян запрещены [140 ].

Европейский Союз (ЕС) определяет ГМО как организм, за исключением человека, в котором генетический материал был изменен таким образом, который не происходит естественным образом в результате спаривания и/или естественной рекомбинации. Законодательство ЕС по экологическим вопросам, направленное на защиту окружающей среды, определяется сочетанием правил, которые непосредственно применяются в государствах-членах, и директив, которые устанавливают рамки в соответствующей области, но затем переносятся государствами-членами в национальное законодательство. Директива 2001/18/ЕС о преднамеренном выбросе ГМО в окружающую среду и Директива 2015/412 об ограничении или запрещении культивирования генетически модифицированных организмов на их территории являются примером использования рамочных правил в ЕС. Эта директива направлена ​​на защиту здоровья человека и окружающей среды, когда: 1. выпуск ГМО в окружающую среду для любых целей, например, для экспериментального использования; и 2. размещение ГМО на рынке в качестве продукта или его части. Преднамеренный выброс в окружающую среду означает любое преднамеренное введение в окружающую среду ГМО или комбинации ГМО, в отношении которых не применяются специальные меры по ограничению их контакта и обеспечению высокого уровня безопасности для населения в целом и окружающей среды [141 ].

Даже если в стране есть стабильный протокол регулирования и законодательство о НПБТ, каждый случай должен анализироваться индивидуально. Правительствам следует рассмотреть нормативно-правовую базу технологий редактирования генома и при необходимости установить соответствующие правила, не создавая препятствий для коммерциализации продуктов, полученных с помощью этих технологий. Тем не менее, в большинстве стран нет никакого законодательства, и они должны создать законодательную базу для использования NPBT. Необходимо дальнейшее развитие нормативно-правовой базы, чтобы эффективно использовать возможности технологий и направлять их на полезные приложения. Человечество должно оставаться у руля, а не быть растоптанным технологиями [ 136 ].

6. Выводы

В этом обзоре мы обсуждаем преимущества и недостатки различных стратегий повышения накопления и устойчивости ТМ путем редактирования генома и трансформации растений-металлофитов (то есть, растений-гипераккумуляторов и аборигенных растений-металлофитов) с потенциалом фитоэкстракции.

Лучшими генами-кандидатами для улучшения процесса фитоэкстракции, которые мы обсуждали в этом обзоре, являются металлотионеин (MT), фитохелатин (PC), фитохелатинсинтаза (PCS), переносчики металлов и гены, связанные с антиоксидантами. Эти гены улучшают продуктивность растений в почве, загрязненной тяжелыми металлами. Они увеличивают способность поглощения и накопления металлов, антиоксидантную активность, а также транслокацию и компартментализацию, что приводит к повышению толерантности и накоплению металлов. Таким образом, комбинированная сверхэкспрессия генов переносчиков металлов и связывания металлов с генами, связанными с антиоксидантами, является важной стратегией для разработки растений с высокой устойчивостью к биомассе для фитоэкстракции. В целом упомянутые выше стратегии повышения накопления косвенно повышают толерантность и наоборот, что указывает на тесную взаимосвязь этих процессов.

Другие интересные стратегии включают использование эпигенетической регуляции, стэкинга генов и редактирования генов. Хотя одногенная трансгенная стратегия очень эффективна для повышения толерантности к металлам и их накопления, способность растений к фитоэкстракции является многофакторной. В целом, комбинация подходов, которая модифицирует более одного гена (т.е. суммирование генов), более эффективна, чем отдельная трансформация, демонстрируя большой потенциал для повышения эффективности фиторемедиации. Кроме того, внедрение трансгенных растений имеет правовые и нормативные ограничения.

Соответственно, выбор подходящих видов растений является одним из наиболее важных соображений в процессе фитоэкстракции in situ. Местные растения, которые уже растут на загрязненных участках, обладают наибольшим потенциалом одновременного использования в качестве хороших кандидатов для фитоэкстракции и восстановления растительности. В целом, растения, которые естественным образом растут и колонизируют участки с высокой концентрацией металлов, являются лучшими кандидатами для изучения не только в качестве источника целевых генов, но и в качестве учебных моделей.

Использование NPBT, таких как CRISPR, для улучшения способности местных растений к фитоэкстракции, по-видимому, является наиболее многообещающей стратегией для технологий фитоэкстракции, позволяющей максимально раскрыть свой потенциал и снизить риск для окружающей среды. Геномная инженерия с помощью CRISPR демонстрирует потенциал использования геномов растений для улучшения фиторемедиации. Система CRISPR-Cas является наиболее универсальным инструментом редактирования генома в истории молекулярной биологии, поскольку ее можно использовать для изменения различных геномов (например, геномов как растений, так и животных), включая геномы человека, с беспрецедентной легкостью, точностью и эффективностью. эффективность. Будущие исследования должны быть сосредоточены на использовании NBPT для усиления роста растений и производства биомассы, транспорта, метаболизма и разделения ТМ, а также развития корневой системы, среди прочего, для повышения их потенциала фиторемедиации. Кроме того, поскольку CRISPR является таким универсальным инструментом, мы можем нацеливаться на несколько генов или признаков одновременно, достигая более эффективного редактирования генома и экономя время и ресурсы, не оставляя молекулярных следов. Регуляторно-нормативная база для NPBT не должна стать препятствием для разработки технологий редактирования генома, полезных для окружающей среды и здоровья населения. Можно улучшить растительные технологии очистки окружающей среды, загрязненной тяжелыми металлами, и одновременно восстановить элементы, представляющие экономический интерес. Регуляторно-нормативная база для NPBT не должна стать препятствием для разработки технологий редактирования генома, полезных для окружающей среды и здоровья населения. Можно улучшить растительные технологии очистки окружающей среды, загрязненной тяжелыми металлами, и одновременно восстановить элементы, представляющие экономический интерес. Регуляторно-нормативная база для NPBT не должна стать препятствием для разработки технологий редактирования генома, полезных для окружающей среды и здоровья населения. Можно улучшить растительные технологии очистки окружающей среды, загрязненной тяжелыми металлами, и одновременно восстановить элементы, представляющие экономический интерес.