Методическая разработка по теме :Ферменты

Глава 3. ФЕРМЕНТЫ

    Ферментами или энзимами называют вещества белковой природы, ускоряющие протекание химических реакций. Ферменты отличаются тремя уникальными свойствами: 1) это самые эффективные из известных катализаторов; 2) большинство ферментов отличаются специфичностью действия; 3) действие их регулируется, т.е. они способны переходить от состояния с низкой активностью к состоянию с высокой активностью и обратно.

    Все ферменты относятся к глобулярным белкам, причем каждый фермент выполняет специфическую функцию, связанную с присущей ему структурой. Однако максимальная активность многих (но не всех) ферментов зависит от участия небелковых соединений, называемых кофакторами.

    Различают неорганические кофакторы ( например, Zn²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺, K⁺, Na⁺) и органические, которые обычно называют коферментами, (большая  часть их представляет собой витамины).

    Молекулярный комплекс белка и кофактора называют холоферментом; он обладает максимальной каталитической активностью. Белковый компонент, лишенный кофактора, называется апоферментом, он обладает очень низкой активностью, а часто вообще неактивен.

    Тип сязи между кофактором и ферментом может быть различным. В некоторых случаях они существуют отдельно и связываются друг с другом только на время протекания реакции. В других случаях кофактор и фермент связаны постоянно, иногда очень прочно, ковалентными связями.

    Как белковые вещества, ферменты термолабильны и теряют активность при температурах, при которых происходит денатурация белка.

     Для каждого фермента существует оптимальная область значений рН, в которой он наиболее активен.

    Важным свойством ферментов является их специфичность действия. Некоторые из них обладают абсолютной специфичностью: каждый фермент катализирует единственную реакцию, вследствие того, что топография активного центра такого фермента соответствует топографии одного-единственного субстрата.

    Многие ферменты обладают лишь относительной специфичностью – они способны катализировать   один тип реакции с более чем одним структурно-подобным субстратом.   

    Хотя детальный механизм действия каждого фермента уникален, все ферменты "работают" сходным образом: фермент Е обратимо связывается с субстратом S с образованием промежуточного фермент-субстратного комплекса ЕS, котрый затем распадается с образованием продукта Р и свободного фермента Е в исходном виде:

Е+ S « Е S ® Р + Е

    Скорость ферментативного процесса описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, связывающего концетрацию субстрата [S]  с  начальной скоростью V₀ :

V₀ = V_max [S]  / K_m + S

где V_max – максимальная скорость; K_m – константа Михаэлиса;  [S] – концентрация субстрата.

    В большинстве случаев о количестве ферментов судят по его активности.

    Согласно Междурудной номенклатуре, ферментативную активность выражают в каталах (сокращённо –кат). Один катал – есть каталитическая активность способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 моль в секунду.  

    Также для выражения активности используются единицы активности фермента (Е).. 1Е катализирует превращение субстрата со скоростью 1мкмоль/мин при оптимальных условиях. 1Е =16,67 нкат.

    Удельная активность фермента выражается числом единиц Е на 1мг белка,  концентрация фермента в растворе – числом единиц Е на 1мл.

    Удельную активность можно расчитать по формуле:

                            Е_уд = Е_мол · 1000/ М_r

Где Е_уд – удельная активность; Е_мол – молярная (молекулярная) активность; М_r – относительная молярная масса фермента.

    Молярная активность (или число оборотов) выражается числом молей субстрата,  реагирующего с 1 молем фермента за 1мин.

Все ферменты по типам катализируемых реакций подразделяются на 6 классов:

оксиредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции; трансферазы - катализируют межмолекулярный перенос различных химических групп;  гидролазы – гидролитически расщепляют химические связи; лиазы – расщепляют связи способом, отличным от гидролиза и окисления; изомеразы – ускоряют реакции взаимопревращения различных изомеров; лигазы – катализируют реакции образования связей в реакции конденсации двух различных соединений за счет энергии гидролиза АТФ.

    Каждый из названных классов, в свою очередь, делится на подклассы и имеет свой шифр из четырехзначного числа.

     Действие ферментов может усиливаться веществами, которые называются активаторами ( соли, ионы металлов и др.); противоположное, тормозящее влияние оказывают на ферменты ингибиторы. Действия большинства лекарственных препаратов, инсектицидов и гербицидов основано на способности ингибировать (затормаживать) работу клеточных ферментов (обычно какого-то

определенного).

Пример 1. В реакцию вступило 10^-6 М фермента, для которого характерно  6·10⁵ с^-1 оборотов. Рассчитайте концентрацию образующегося продукта.

Решение: Под числом оборотов понимается число молей субстрата, катализируемой 1 молем фермента.

Значит: 1 моль фермента катализирует образование 6 · 10⁵ моль продукта

                  10^-6                         -------                                   х

                                        х =  10^-6 · 6·10⁵/1= 6·10^-1. 

Ответ: 6·10^-1 М.

Пример 2. Относительная молекулярная масса пируваткарбоксилазы (М_r) 183 кДа. Рассчитайте молекулярную активность фермента, если его удельная активность составляет 1,2·10³Е.

Решение: Воспользуемся формулой:

Е_уд = Е_мол. · 1000 /М_r ;  Значит,  Е_мол =1,2·10³ · 1,83·10⁵ / 1·10³  = ~2,2·10⁵.

Ответ: 2,2 · 10⁵.

Пример:3. При какой концентрации субстрата фермент для которого максимальная скорость превращения субстрата составляет 40 мкмоль/мин, а величина К_м= 0,002М будет работать со скоростью равной 1/8 максимальной.

Решение: Воспользуемся формулой:

   V₀ = V_max [S]  / K_m + S;

Согласно условию V₀ = V_max/8  = 40 мкмоль/мин /8 = 5мкмоль/мин.

Значит: 5мкмоль/мин = 40 мкмоль/мин · [S]/ 0,002М + [S].

[S] = ~ 2,8·10^-4 моль.

 Для закрепления темы предлагается решение следующих задач:

     1. При нагревании раствора содержащим гексокиназу  фермент постепенно утрачивает свою каталитическую активность . Почему?

     2. Ферментативная активность лизоцима максимальна при рН=5,2 и уменьшается как при снижении, так и при повышения этого количества рН. Объясните почему?

3.Печень крысы гомогенизировали, затем фракционировали на субклеточные фракции путём дифференциального центрифугирования.

Условия опыта	Субклеточные фракции
	Ядерная	Митохонд- риальная	Микро сомная	Клеточ ный сок
Количесво превращённого субстрата (в мкмоль на пробу)	200	500	320	240
Время икубации фермента с Субстратом (в мин)	5	15	10	8
Объём пробы  (в мл)	0,5	1,0	2,0	0,4
Концентрация белка (в мг/мл)	2.5	3,2	0,8	0,8

В каждой фракции определяли активность гистидазы – фермента, катализирующего отщепление аминогруппы от гистидина. Условия для определения активности даны в таблице. Определите локализацию гистидазы. Обоснуйте свой ответ. ( Гистидаза в основном локализована в клеточном соке ).

 В таблице представлены данные, характеризующие зависимость ферментативной реакции (V) от концентрации субстрата (S):

S, M	V, мкм/мин
1·10-6	20
2·10-5	32
1·10-4	39
1·10-3	40

Используя данные таблицы, нарисуйте график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. Найдите приблизительные значения V_mах и K_m.  (V_mах =40 мкм/мин;   K_m = 1·10^-6М).

Рассчитайте удельную активность фермента, если за 30с 1 мг фермента катализирует (при оптимальных условиях) превращает 50 мкмоль пирувата. (мкмоль пирувата · мин^-1· мг^-1).

    3. Сладкий вкус зерён в свежесобранных початках кукурузы обусловлен высоким  содержанием  в них сахара.  Кукуруза, которую продают через несколько дней после сбора, имеет более низкую сахаристость, так как около 50% свободного сахара в зёрнах превращаются в крахмал в течение одного дня хранения. Чтобы сохранить сладкий вкус свежесобранной кукурузы, очищенные початки помещают на несколько минут в кипящую воду («бланшируют»), а затем охлаждают в холодной воде. Кукуруза, обработанная таким образом и хранящаяся в замороженном виде, сохраняет свой сладкий вкус. В чём биологическая основа этой обработки?

   4. Активный центр фермента обычно представляет собой «карман» на поверхности фермента, выстланный боковыми цепями аминокислот, необходимыми для связывания субстрата и катализа его химического превращения. Молекула карбоксипептидазы, последовательно отщепляет С-концевые аминокислотные остатки от субстратов (пептидов), состоит из одной полипептидной цепи (307 аминокислотных остатков). Три главные каталитические группы в активном центре –это аргинин 145, тирозин 248 и глутаминовая кислота 270 (номер указывает положение аминокислоты в аимнокислотной последовательности фермента).

 а) Если бы карбоксипептидаза представляла собой идеальную α-спираль, то на каком расстоянии в нм друг от друга находились бы аргинин 145 и тирозин 248; аргинин и глутаминовая кислота 270 ? (18,8 нм).

б) Объясните каким образом эти три аминокислоты, расположенные так далеко друг от друга  в полипептидной цепи, могут катализировать реакцию, участники которой занимают пространство размером в несколько десятых долей нанометра?

в) Если в процессе гидролиза участвуют только эти каталитические группы, для чего ферменту необходимо иметь так много аминокислотных омстатков?

 5) Фермент уреаза повышает скорость гидролиза мочевины при рН=8,0 и 20°С в 10¹⁴ раз. Если данное количество уреазы может полностью гидролизовать данное количество мочевины за 5 мин при  рН 8,0 и 20°С, сколько времени потребовалось бы для полного гидролиза мочевины в тех же условиях без уреазы? Предполагается, что обе реакции проходят в стерильных условиях без доступа бактерий. (9,5× 10⁸).

     6. Почему в пробирке, содержащей раствор крахмала и слюны человека, при проведении реакции Троммера наблюдается красное окрашивание?

    7. Почему добавление фенолфталеина в раствор, содержащий мочевину и фермент уреазу,  вызывает розовое окрашивание?

    8.Метанол (древесный спирт), который когда-то использовался как антифриз для автомобилей, очень токсичен; приём внутрь всего лишь 30мл метанола может привести к смерти. Такая необычайно высокая токсичность метанола обусловлена действием не столько самого метанола, сколько продукта его метаболизма – формальдегида. Метанол быстро окисляется до формальдегида под действием фермента печени алкогольдегидрогеназы:

NAD⁺ + CH₃OH  Þ NADH + H⁺ + HCOH

Одним из методов лечения при отравлении этанолом состоит в том, что больному назначается этанол (этиловый спирт) либо внутрь,  либо внутривенно в количествах, которые у здорового человека вызывают интоксикацию. Объясните, почему такое лечение оказывается эффективным?

    9. Установлено, что 1г гемоглобина соединяется с 1,34мл кислорода при н.у. Гемоглобин содержит 0,335% железа. Используя эти данные, оцените молярные соотношения кислорода и железа в гемоглобине при полном насыщении его кислородом. (1моль Fe соединяется с примерно 1моль 0₂).

    10. Гемоглобин взаимодействует с кислородом с образованием комплекса, в котором на 4 моль кислорода приходится 1 моль гемоглобина. Вычислите число молекул гемоглобина, необходимое для переноса 1мл кислорода (н.у.). (6,7×10¹⁸).

    11.Вычислите в нанометрах длину молекулы рибонуклеазы, содержащей 124 аминокислотных остатка, если она а) существует в линейной конфигурации; б) полностью альфа-спирализована  (а-44,64нм; б- 18,6нм).

    12.Молекула папаина (растительная протениаза) содержит в своём составе 211 аминокислотных остатков. Псевдокристалическая часть молекулы папаина состоит из четырёх коротких  a-спиралей, каждая из которых содержит 10 аминокислотных остатков, и фрагмента полипептидной цепи из 9 аминокислотных остатков, находящегося в b-конформации. Определите количество аминокислотных остатков, составляющих аморфную часть молекулы папаина, и степень спирализации, характерную для данного белка. (162 аминокислотных остатка; 19%).

   13. Ренгеноструктурный анализ показал, что в молекуле карбоксипептидазы около 30% аминокислотных остатков включены в состав a-спирпалей, а 20% - сосредоточены в зоне, образованной регулярно повторяющимися складками вытянутой полипептидной цепи. Рассчитайте количество аминокислотных остатков, находящихся в аморфной части молекулы,  а также в её  a-спиральной области и складчатой зоне, если общее число аминокислотных остатков в молекуле карбоксипептидазы равно 255. (128-в аморфной; 76-в a-спирпальной; 51 - в складчатой  b-структуре ).

   14.Рассчитайте концентрацию меди (%) в медьсодержащем ферменте аскорбатоксидазе (М=150 тыс) если каждая молекула содержит 6 атомов меди. (~0,25%).

    15.Рассчитайте молекулярную массу протомера кристалическоой каталазы, представляющего протеид с активной группой в виде железо-порфированного комплекса с одним атомом железа, если концентрация железа в кристалической каталазе равна 0,12%. (46780).

    16.Рассчитайте молекулярную массу дигидрооратдегидрогеназы, в состав которой входит 2 атома железа при содержании последнего 0,18% . (62200).

     17. В состав сукцинатдегидрогеназы сердца входят 8 атомов железа при содержании последнего 0,22%. Рассчитайте молекулярную массу фермента. ( ~200тыс).

      18. При какой концентрации субстрата фермент, для которого максимальная скорость превращения субстрата представляет 30 мкмоль/мин×г , а величина К_м=0,005М, будет работать со скоростью, равной ¼ максимальной? (1,7×10^-3).

      19. Фермент карбоангидраза в концентрации 10^-6 М катализирует  образование 0,6М Н₂СО₃  в секунду, согласно реакции: Н₂О + СО₂ Û Н₂СО₃. Определите число оборотов характерное для фермента. (6·10⁵ ).

     20.Для карбоангидразы характерно 6·10⁵ с^-1 оборотов. Рассчитайте концентрацию фермента (в молях)  необходимую для образования 0,6 М Н₂СО₃ в секунду, согласно реакции Н₂О + СО₂ Û Н₂СО₃. (10^-6 М).

     21.Рассчитайте концентрацию образующегося продукта (в молях) в ферментативной реакции Н₂О + СО₂ Û Н₂СО_3, катализируемой карбоангидразой, если в реакцию вступило 10^-6 фермента. Для карбоангидразы характерно 6·10⁵ с^-1 оборотов. (0,6 М).

    22. Относительная молекулярная масса пируваткарбоксилазы – Мr = 183тыс., альдолазы - Мr = 142тыс., пируваткиназы - М_r = 237тыс., цитохром – С-редуктазы – М = 75тыс.. Рассчитайте молекулярную активность фермента, если их  удельная активность составляет 1,2 · 10³ Е; ~30 Е; 26Е ;  1,73 · 10² Е соответственно. (2,2 · 10⁵ ;    4,2 · 10³  ; 6,0 · 10³ ;

1,3 · 10⁴ ).     

    23. Рассчитайте удельную активность каталазы (М_r=252тыс.), лактатдегидрогеназы (М_r=140тыс.), карбоангидразы (М_r=30тыс.) активность бутирил-СоА-дегидрогеназы (М_r=200тыс.),  если их молекулярная активность составляет 5 · 10⁶;  3,7 · 10⁴; 0,96 · 10⁸; 1,3 · 10⁴ соответственно. (2,0 · 10⁴ ; 3,2 · 10⁶ ;  3,2 · 10⁶;  10²).               

    24.Карбоангидраза эритроцитов, имеющая молекулярную массу 30тыс катализирует обратимую реакцию гидратации СО₂:

Н₂О + СО₂ Û Н₂СО₃,

которая играет важную роль в транспорте СО₂ из тканей в лёгкие. Рассчитайте число оборотов карбоангидразы, если при оптимальных условиях 10мкг чистой карбоангидразы катализируют гидратацию 0,30г СО₂ в 1мин при 37°С. (2,0×10⁷ мин^-1).

25.Укажите какие пептиды получаются при воздействии химотрипсина на полипептид, имеющий первичную структуру: (Н₂N) сер-тир-мет-глу-гис-фен-арг-три-гли-лиз-про-вал-гли-(лиз)₂-(арг)₂-про-вал-лиз-вал-тир-про-асп-гли-ала-глу-асп-глу-лей-ала-глу-ала-фен-про-лей-глу-фен (ОН). (сер-тир; мет-глу-гис-фен; арг-три; гли-лиз-про-вал-гли-(лиз)₂-(арг)₂-про-вал-лиз-вал-тир; про-асп-гли-ала-глу-асп-глу-лей-ала-глу-ала-фен; про-лей-глу-фен ).