Исследовательская работа "Анализ условий питательной среды для бактерий"

Управление образования администрации города Черемхово

Муниципальное  общеобразовательное учреждение

«Лицей г.Черемхово»

Анализ условий  питательной среды для бактерий

Вид работы: исследовательская

Автор: обучающаяся  8 класса 

Федощева Екатерина

                                                        Руководитель:

Булгакова Светлана Владимировна,

учитель биологии

г. Черемхово

2016

Содержание

Введение	3
Обзор литературы	5
1. Питательные среды для размножения бактерий: условия, виды	5
1.1. Бактерии и условия их культивирования	7
1.2.  Принципы культивирования бактерий	9
1.3.  Основные питательные среды.	10
2.Влияние окружающей среды на микроорганизмы	11
3. Проведение бактериологического исследования	12
3.1. Организация проведения бактериологического исследования	12
3.2. Результаты бактериологического исследования	15
Заключение	18
Список использованных источников	19
Отзыв руководителя
Приложения

Введение.

Полезные и опасные, милые и ужасные, смертоносные и дающие жизнь. Они вокруг и их невозможно увидеть. Непросто отыскать более интересный объект для исследований. По количеству невероятных сюжетов мир бактерий можно сравнить с миром привидений. Но в отличие от изучения привидений, из информации о бактериях можно извлечь массу практической пользы, чем научное сообщество и занимается вот уже более ста лет.   

Учёные прогнозируют, что результаты изучения жизни бактерий в будущем приведут к:

-         открытию секрета долголетия и даже бессмертия (во льдах найдены бактериальные сообщества, в которых обнаружены представители возрастом более миллиона лет);

-         получению альтернативных источников энергии, в том числе и пищи;

-         получение новых материалов биологического происхождения;

-         формированию новых экосистем.

 Любое открытие в микробиологии сразу же подхватывается промышленниками, которые внедряют новые технологии в современное производство и предлагают результаты рынку.

Знакомясь с новинками, человек получает возможность не только оперировать более значительным объемом средств в достижении утилитарных целей, но и самостоятельно заглянуть в прошлое планеты Земля и в ее будущее.     

Проблема заключается в том, что микроорганизмы распространены повсеместно.  Все живые существа -  растения, животные и люди  - постоянно взаимодействуют с микробами, являясь часто не только их хранилищами, но и распространителями. Ни сверхнизкие температуры Антарктики, ни кипящие струи гейзеров, ни насыщенные растворы солей в соляных бассейнах, ни сильная инсоляция горных вершин, ни резкие колебания кислотности среды, ни многое другое не мешают существованию и развитию микрофлоры в природных субстратах. Взаимодействие человека с бактериальной микрофлорой неизбежно, а его характер зависит от биологической и экологической грамотности человека. Это делает актуальной тему исследования «Анализ условий  питательной среды для бактерий».

Цель исследования: изучение условий среды, способствующей росту и  размножению бактерий.

Задачи исследования:

1.            Получить представление  о бактериях и условиях их культивирования;

2.            Рассмотреть виды питательных сред для размножения бактерий;

3.            Понять особенности размножения бактерий на жидких и плотных питательных  средах;

4.            Раскрыть влияние факторов окружающей среды на микроорганизмы;

5.            Провести бактериологическое исследование.

Объект исследования: бактерии.

Предмет исследования: рост бактерий на различных питательных средах.

Гипотеза: скорость  размножения микроорганизмов помимо видовой принадлежности зависит от состава  питательной среды, рН, температуры, аэрации и других факторов.

Методы исследования:  поисковый метод; наблюдение; анализ, синтез, сравнение; обобщение.

Научная значимость исследования заключается в расширении аппарата для решения  заданий ЕГЭ .  Практическая значимость исследования состоит в том, что его материалы могут быть использованы в образовательной деятельности по биологии, для проведения занятий в кружке, факультативных занятий.  

Обзор литературы

Бактерии и их размножение привлекло внимание учёных  со времён Левенгука, когда он впервые увидел их в микроскоп. В 1850-х годах Луи Пастер положил начало изучению физиологии и метаболизма бактерий, а также открыл их болезнетворные свойства.   Это послужило возникновению микробиологии – науки, которая

В разное время изучением бактерий занимались Гусев М. В.и Минеева Л. А., Заварзин Г. А., Герхардт Ф. и др. учёные микробиологи.

Рассмотрим наиболее значимые на современном этапе развития микробиологии научные труды, посвящённые питательным для бактерий средам.

К. Френкель в своей монографии «Основы учения о бактериях»[1]   подробно охарактеризовал  питательные среды, принципы их классификации, требования, предъявляемые к питательным средам, условия культивирования микроорганизмов.

H. В. Прозоркина, П. А. Рубашкина. Свой труд «Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии» посвятили описанию методов микробиологических исследований[2]. Эти труды и послужили методологической основой для нашего исследования.

1.     Питательные среды для размножения бактерий: условия, виды

1.1.          Бактерии и условия их культивирования

1.Размножение бактерий на жидких и плотных питательных  средах

Бактерии, как правило, характеризуются высокой скоростью размножения по сравнению с другими прокариотами. Скорость их размножения, помимо видовой принадлежности, зависит от состава питательной среды, рН, температуры, аэрации и других факторов. На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток, называемые колониями. Внешний вид ко­лоний у многих бактерий настолько характерен, что может слу­жить одним из дифференциальных признаков для их идентифика­ции. Колонии разных видов отличаются по своим размерам, фор­ме, поверхности, окраске, прозрачности и др. Однако эти призна­ки могут изменяться в зависимости от условий культивирования.

      На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помут­нения, либо осадка.

  Размножение бактерий определяется временем генерации, т. е. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возрас­та, популяции, состава питательной среды, температуры и других факторов. В оптимальных условиях время генерации у разных бактерий колеблется довольно в широких пределах: от 20 минут у кишечной палочки до 14 ч у микобактерий туберкулеза, в связи с чем их колонии образуются через 18–20 ч либо через 3–5 недели соответственно[3].

При выращивании бактерий в жидкой питательной среде наблюдается последовательная смена отдельных фаз в развитии популяции, отражающая общую закономерность роста и размно­жения бактериальных клеток.

Динамика развития бактериальной популяции представлена на рис.1

Рис.1. Динамика развития бактериальной популяции

I    - исходная стационарная фаза начинается после внесения бактерий в питательную среду. В течение данной фазы число бактериальных клеток не увеличивается.

II - лаг-фаза, или фаза задержки размножения, характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой. Две первые фазы можно назвать периодом адаптации бактериальной популяции, продолжительность которого определяется возрастом культуры, а также количеством и качеством питательной среды.

III  -лог-фаза,   или  логарифмическая   (экспоненциальная), фаза отличается максимальной скоростью размножения клеток и увеличением численности бактериальной популяции в геометрической прогрессии. Логарифмическая фаза у бактерий с коротким временем генерации продолжается несколько часов.

IV  - фаза отрицательного ускорения характеризуется меньшей активностью бактериальных клеток и удлинением периода генерации. Это происходит в результате истощения питательной среды, накопления в ней продуктов метаболизма и дефицита кислорода.

1.2.Принципы культивирования бактерий

     Микроорганизмы  культивируют, как правило, на искусственных питательных средах. В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида питательные среды должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метаболизма.

Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, в научно-исследовательской работе и в микробиологическом производстве вакцин, антибиотиков и других биологически    активных    продуктов    микробной    жизнедеятельности.[4]

     Условия культивирования также зависят от свойств соответствующих микроорганизмов. Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37 °С в течение 1–2 сут. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша – в 2–3 сут, а микобактерии туберкулеза – в 3–4 нед.

     Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания используют метод глубинного культивирования, который заключается в непрерывном аэрировании и перемешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое применение в биотехнологии. 

Требования к питательным средам. Для выращивания бактерий в лабораторных условиях, исследования их разнообразных свойств, длительного хранения используют питательные среды. Они должны отвечать определенным стандартам, создавая оптимальные условия для роста, размножения и жизнедеятельности микроорганизмов.

      В первую очередь, бактерии нуждаются в азоте, углероде и водороде для построения собственных белков. Водород и кислород для клеток поставляет вода. Источником азота выступают многочисленные вещества, в основном, животного происхождения (мясо говяжье, рыба, мясо-костная мука, казеин. Можно использовать и заменители мяса – плаценту, кровяные сгустки, дрожжи. Следовательно, в состав сред должны быть введены источники питательных веществ и вода, а также ростовые факторы (витамины группы В, ферменты). Универсальным источником их служат экстракты из белков животного и растительного происхождения. Для микробов с более сложными пищевыми потребностями в состав сред включают  субстраты – кровь, сыворотку, яичный желток, кусочки печенки, почек, мозговой ткани и др.[5]

     Среды должны быть сбалансированными за микроэлементным составом и содержать ионы железа, меди, марганца, цинка, кальция, натрия, калию, иметь в своем составе неорганические фосфаты.

     Среды должны иметь определенную вязкость, плотность, иметь определенную влажность (до 20 % воды), быть прозрачными и обязательно стерильными.

      Oсновные требования к питательным средам: прозрачность; стерильность;   лёгкая усвояемость; определенный состав азотистых веществ, углеводов, витаминов; определённая вязкость.

                                   1. 3. Основные питательные среды.

      Многочисленные потребности микроорганизмов предопределяют большое разнообразие питательных сред, а для отдельных видов бактерий существуют специальные среды. Часть их готовят в лабораториях непосредственно перед посевом, но с каждым годом появляются все новые и новые среды заводского изготовления (сухие), которые способны удовлетворить самые прихотливые потребности микробиологов. Они сохраняются длительное время, имеют стандартный состав.

      Среды разделяются на естественные и искусственные. Для создания естественных сред используют свернутую сыворотку, молоко, яйца, мышечную ткань.    

      Искусственные среды создают путем комбинирования разнообразных субстратов, которые обеспечивают те или другие потребности микроорганизмов. Их используют в основном для экспериментального изучения отдельных звеньев метаболизма бактерий.

      В зависимости от своей плотности, среды разделяются на жидкие, полужидкие и плотные. Полужидкие и плотные среды готовятся из жидких, добавляя соответственно 0,3-0,7 % но 1,5-2,0 %  агара. Последний представляет собой волокнистый материал, который добывают из морских водорослей. Состоит он из полисахаридов (70-75 %), белков (2-3 %).   Для создания плотных сред используют также желатин (10-15 %), свернутую сыворотку крови.

     В зависимости от потребностей бактериологов питательные среды разделяются на пять основных групп (прил.1 таблица 1) .

Первая группа – универсальные (простые) среды. К ним принадлежат мясо-пептонний бульон (МПБ) и мясо-пептоннийагар (МПА). За своим составом, наличием питательных веществ они пригодны для культивирования многих видов бактерий.

Вторая группа – специальные среды. Они используются в тех случаях, когда микроорганизмы не растут на простых. К ним принадлежит кровяной, сывороточный агары, сывороточный бульйон, асцитический бульйон, асцит-агар и другие.

Третья группа – элективные  среды, на которых микроорганизмы определенного вида растут быстрее, более интенсивно, опережают в своем развитии другие виды бактерий. 

Четвертая группа  селективные среды, которые благодаря добавлению определенных компонентов (желчь, краски, антибиотики и др.) способны подавлять развитие одних видов микроорганизмов, но не влияют на другие виды. 

Пятая группа – дифференциально-диагностичнеские среды. Это большая группа сред, которые позволяют определить определенные биохимические свойства микроорганизмов и проводить их дифференциацию.

              

      Рис.2.Среда  Плоскирева.                         Рис.3.   Среда Левина

2.Влияние окружающей среды на микроорганизмы

Рассмотрим факторы окружающей  среды, влияющие на микроорганизмы.

          Температура. Низкие температуры бактерии выдерживают сравнительно легко. Культуры микроорганизмов в замороженном виде сохраняются в лабораторных условиях более чем 80 лет. Выделено жизнеспособный микроорганизм из толщи ледников,   возраст которых 12 000 лет.

Холерный вибрион не погибает при температуре  -32 °С; некоторые виды бактерий хранят жизнеспособность при температуре жидкого воздуха ( -190 °С),  жидкого водорода (-253 °С). 

Низкие температуры прекращают процессы гниения и брожения. На этом принципе основывается использование в практике ледников, погребов и холодильных установок для хранения пищевых продуктов.

       Пагубно действуют на бактерии высокие температуры. Большинство  бактерий погибают при температуре 58–60 °С через 30–60 мин, при 100 °С – в течение  2–3  мин. Силикатные бактерии сохраняются жизнеспособными после деяния на них нагревание до  160 °С.

       Высушивание. Стойкость микроорганизмов к высушиванию разная. Чувствительные к высушиванию гонококки, менингококки, трепонемы, лептоспиры, гемофильные бактерии, фаги. Холерный вибрион не погибает под воздействием высушивания 2 сутки, шигели– 7, чумная палочка – 8, дифтерийная –30, брюшнотифозная – 70, стафилококки и микобактерии туберкулеза – 90 суток. Высохшая мокрота больных туберкулезом остается заразной 10 месяцев, споры бацилл сибирской язвы сохраняются до 10 годов, плесневых грибов – 20 лет.

       Лучевая энергия. Разные виды излучения имеют бактерицидное или стерилизующее действие. К ней принадлежат ультрафиолетовое, рентгеновское, альфа-, бета-, гамма- и нейтронное излучение. Наиболее выраженное бактерицидное действие имеет прямой солнечный луч.

       Высокое давление, ультразвук, механическое сотрясение. Воздействие высокого атмосферного давления 10 132,5 – 91 192,5 кПа (100–900 атм) на глубине морей и океанов 1000–10 000 м бактерии переносят легко. Дрожжи хранят свою жизнеспособность при давлению 50 662,5 кПа (500 атм). Некоторые бактерии, дрожжи, плесневые грибы выдерживают давление 303 975 кПа (3000 атм),   фитопатогенные вирусы – 506 625 кПа (5000 атм).

Ультразвук имеет бактерицидные свойства, которые используют для стерилизации пищевых продуктов, изготовления вакцин и дезинфекции предметов.

3. Проведение бактериологического исследования

3.1 Организация проведения бактериологического исследования

№ п/п	Этап	Срок	Результат
1	Постановка проблемы, определение цели и задач исследования.	25.02.16 –28.02.16	Формулировка проблем, целей и задач, которые необходимо достичь и решить в ходе выполнения исследовательской работы
2	Разработка плана исследовательской  работы .	01.03.16 –03.03.16	Разработанный план работы над исследованием.
4	Выдвижение гипотезы исследования	05.03.16–07.03.16	Презентация и сборник, которые будут использоваться на уроках математики и физики, а также на часах общения.
5	Поиск информации по теме, т.е.  изучение литературы, материалов Интернет-ресурсов о  принципах культивирования бактерий	11.03.16–16.03.16	Изучение научных источников, подбор краткой информации, раскрывающей тему.
6	Проведение исследования	27.03.16–29.03.16	Проведение экспериментальной работы в лаборатории
7	Обработка полученных результатов	01.04.16–07.04.16	Анализ полученных результатов
8	Оформление  исследовательской работы	09.04.16–15.04.16	Написание исследовательской работы

Объекты исследования: сенная палочка и молочный стафилококк

Метод исследования: бактериологический

Методика исследования: Для  посева микроорганизмов в левую руку берут две пробирки. В одной находится питательная среда, в другой – исследуемый материал. Пробирки зажимают большим и указательным пальцами. Для того, чтобы можно было наблюдать за содержанием пробирок, их держат сверху кисти руки. Сначала стерилизуют петлю в верхней части пламени газовой горелки. Пробирки открывают и край их проносят через пламя горелки. Петлю опускают в пробирку, где есть исследуемый материал, и, осторожно касаясь стенки, охлаждают. В последующем петлю опускают в пробирку и набирают материал. Петлю вынимают из пробирки, пробки и края пробирок проносят через пламя и закрывают. Петлю прожаривают в пламени, чтобы уничтожить микроорганизмы. Через 24 часа производится  рассев взвеси микроорганизмов на выбранные питательные среды в Чашки Петри. Затем чашки  закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 часов. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов[6].  

База исследования: бактериологическая лаборатория ФБУЗ

"Центр гигиены и эпидемиологии в Иркутской области, в Черемховском и Аларском районах"

Консультант: Бушина Тамара Афанасьевна-заведующая бактериологической лабораторией ФБУЗ

Ход исследования

1.Анализируемые образцы высеяли на различные питательные среды: агар Плоскирева, среда Кесслера и  среда Плоскерева  в чашках Петри.  (Рис.3)                                                                        

 

                                                       Рис.3

      2.Высевание  на твердой питательной среде провели  путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем (метод Коха) и   с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха).  

Рассев шпателем (метод Коха) произвели  в следующей последовательности:

1) на поверхность питательной среды в чашке № 1 нанесли стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределили  ее стерильным шпателем;

2) шпатель достали, чашку быстро закрыли и перенесли  шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его.  Распределили культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;

 3) засеянные чашки поместили в термостат и проинкубировали при оптимальной температуре.

     3.Через 24 часа чашки достали из термостата и изучили рост микроорганизмов.  В чашке № 1 увидели  сплошной рост бактерий, в последующих чашках отмечают колонии. (рис.4)

                                                                 Рис.4

       4.Провели  посев бактерий на питательные среды с различным значением рН. Посев проводят в четыре пробирки на МПА с различным значением рН: в одной из них рН равно 3, во второй – 5, в третьей – 7 и в четвертой – 9. Перед началом посева каждую пробирку подписали: указали значение рН и поставили свой номер (рис.5)

Рис.5

3.2. Результаты бактериологического исследования

     1.Провели оценку роста бактерий на средах с различными значениями рН  по степени мутности среды. Перед этим  содержимое каждой пробирки тщательно перемешали  (вращая пробирки между ладонями) и затем сравнили друг с другом. Для оценки интенсивности развития бактерий пользуются условными обозначениями: рост отсутствует (-); рост слабый (+); рост умеренный (++); рост сильный (обильный) (+++). Степень мутности оценивается визуально. Полученные данные зафиксировали в таблице 1 и сделали вывод о влиянии рН на развитие взятых для посева бактерий.

Таблица 1

Интенсивность развития бактерий при различных значения рН

Название бактерий	Оценка роста при различных значениях рН
	3	5	7	9
молочнокислый стрептококк (не образует споры)	+	+++	++	-
Сенная палочка (образует споры)	+	+	+++	++

2.     Провели оценку роста бактерий после воздействия на них высокой температуры. Для этого взяли две пробирки со стерильным изотоническим раствором (Рис.6)        

  

                 (Рис.6).

В одну внесли культуру сенной палочки, а во вторую – молочнокислого стрептококка. Обе пробирки поместили в кипящую водяную баню на 10 мин. После кипячения пробирки охладили и из каждой  сделали посев при помощи петли на косой агар.  Действие высоких температур на спорообразующие и неспорообразующие бактерии определяют по характеру роста микроорганизмов на косом агаре (сплошной, в виде отдельных колоний или обильный, слабый, умеренный, отсутствие роста). Полученные данные зафиксировали в таблице 2

Таблица 2

Действие температуры на спорообразующие и неспорообразующие бактерии

Культура бактерий	Температура	Время действия температуры	Результаты
молочнокислый стрептококк (не образует споры)	100	10 минут	Раствор прозрачный, бактерии погибли
Сенная палочка (образует споры)	100	10 минут	Раствор помутнел, развились колонии из спор

 Заключение

     Сформулированная цель и задачи  исследования достигнуты, гипотеза подтверждена. Сделаны выводы о том, что:

1.                 Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной среды, сильно зависит от физических и химических факторов (температуры, кислотности, аэрации, света и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий.

2.                 Каждый вид микроорганизмов может размножаться при строго определенном  рН среды. Приспособленность к узким зонам реакции среды — это результат эволюции микроорганизмов. Существуют микроорганизмы, способные размножаться в кислых средах, например дрожжи, молочнокислые, уксуснокислые, пропионовокислые бактерии. Сенная палочка и большинство бактерий наиболее активно развиваются при нейтральной реакции среды, а гнилостные бактерии хорошо размножаются в щелочной среде.

3.                 Различное отношение микроорганизмов к реакции среды используют для создания условий для выращивания полезных, а также и для борьбы с вредными микроорганизмами. Например, чтобы не развивалась тягучая болезнь в хлебе, вызываемая сенной палочкой, повышают кислотность теста. Оптимальная величина рН для дрожжей 4—6, для молочнокислых бактерий — 4— 5, для сенной палочки — б—7, для гнилостных бактерий— 7—8., что и доказало наше исследование.

4.                 В процессе жизнедеятельности микроорганизмы изменяют реакцию среды в результате выделения клетками продуктов обмена веществ, влияющих на кислотность.

      Работа по теме  исследования «Анализ условий питательной среды для бактерий» способствовала развитию у  автора умений экспериментировать, делать выводы, рассуждать, анализировать и систематизировать .

    Материалы проведенного исследования выходят за рамки программы курса по биологии на уровне среднего общего образования,  будут полезны учащимся при подготовке к итоговой аттестации, а также могут быть использованы на уроках биологии при изучении темы «Бактерии».

Список использованных источников

1..   Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней. / Н.А. Семина. - М.: Медицина, 1999

2.Борисов Л.Б., Козьмин- Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С.. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии, иммунологии. /Под ред. Борисова Л.И. – М.: Медицина, 1993.-С. 42-56, .79-90.. 3. Джавец Э., Мельник Дж. Л., Эйдельберг Э.А. Руководство  по медицинской микробиологии. 1 т. Пер. с англ. – М.: Медицина, 1982.

4.   Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. М 1976

5. Прозоркина H. В. ,Рубашкина П. А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии, 2002

6.  Френкель К., "Основы учения о бактериях"

7. http://www.bibliofond.ru/view.aspx?id=458689

 8. http://www.vevivi.ru/best/Pitatelnye-sredy-dlya-bakterii-ref168812.html

Приложение 1

Таблица 1

Классификация питательных сред

Простые

Сложные

Жидкие: ПВ, МПБ Плотные: МПЖ, МПА

Специальные: сахар. МПА , МПБ, сывороточный. МПА, кровяной МПА , асцитический МПА Обогащения, накопления: селенитовый МПБ, среды Мюллера, Кауффмана, Китт-Тароцци Элективные: Ру, 1% щелочная ПВ Диференциально-диагностические: 1)    для определениясахаролитическихсвойств (средыГисса , Плоскирева (Рис. 2),Эндо (Рис. 3), Левина) 2)    для определенияпротеолитическихсвойств (свернутаясыворотка, МПЖ , кусочки мышц, белка куриного яйца) 3)    для определенияпептолитическихсвойств (МПБ, ПВ) 4)    для определениягемолитическихсвойств (кров.МПА) 5)    для определенияредуцирующихсвойств (среды с разными красителями)

---

[1] Френкель К., "Основы учения о бактериях"

[2] Прозоркина H. В. ,Рубашкина П. А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии, 2002

[3] Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней. / Н.А. Семина. - М.: Медицина, 1999

[4] Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. М 1976

[5] .http://www.bibliofond.ru/view.aspx?id=458689

[6] Борисов Л.Б., Козьмин- Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С.. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии, иммунологии. /Под ред. Борисова Л.И. – М.: Медицина, 1993.-С. 42-56, .79-90..