Презентация на тему " генная инжинерия "

• 1 слайд

  План:
  Генная инженерия
  1. Генетическая инженерия и её основные достижения. История развития генной инженерии.
  2. Ферменты генной инженерии.
  3. Характеристика рестиктаз.
  4. Получение рекомбинантных ДНК.
  

• 2 слайд

  Список литературы
  Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002. 589с.
  Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. СПб, 2002. 522 с.
  Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2008. 514 с.
  www.biotechnolog.ru
  

• 3 слайд

  1. Генетическая инженерия
  Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.).
  Датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете Пол Берг, Стевен Коэн, Герберт Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.
  

• 4 слайд

  Этапы технологии рекомбинантных ДНК:
  Получение клонируемого гена: из организма–донора нужных генов экстрагируют нативную ДНКи подвергают ее ферментативному гидролизу;
  Введение клонируемого гена в вектор: клонируемую ДНК соединяют с другой ДНК (клонирующий вектор), с образованием рекомбинантной ДНК;
  Перенос рекомбинантной ДНК в реципиентную клетку: рекомбинантную ДНК вводят в компетентные прокариотические или эукариотические клетки;
  Идентификация клеток-реципиентов, содержащих рекомбинантную ДНК;
  Получение клонируемого белка.
  

• 5 слайд

• 6 слайд

  Экспрессия прокариот
  

• 7 слайд

  Экспрессия эукариот
  

• 8 слайд

  Требования к продуцентам рекомбинантных белков
  Полная изученность генома
  Изученность метаболизма на уровне вида
  Отсутствие патогенности или умеренная патогенность
  Способность расти в условиях производства на экономически доступных средах
  

• 9 слайд

  В качестве продуцентов рекомбинантных белков используют:
  Escherichia coli (кишечная палочка)
  Bacillus subtilis (сенная палочка)
  Pseudomonas (псевдомонады)
  Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи)
  Saccaromyces carlsbergensis (пивные дрожжи)
  Pichia pastoris (метилотрофные дрожжи), Hansenula pofymorpha
  культура клеток китайского хомячка CCL-2 (CHO - Chinese hamster ovary)
  

• 10 слайд

  Chinese Hamster Ovary - производство рекомбинантного гликопротеина
  Промышленное производство эритропоэтина человека, касается создания нового штамма клеток китайского хомячка, продуцирующих эритропоэтин человека, который может быть использован для лечебных и исследовательских целей в медицине и биологии.
  Гликопротеид эритропоэтин (ЭПО) является гормоном, регулирующим синтез эритроцитов у млекопитающих. Он продуцируется преимущественно клетками почки в постнатальном периоде, а также эмбриональной печенью.
  Chinese Hamster Ovary (CHO)
  клетки на МКС (минимальной
  культуральной среде)
  http://www.fizlabpribor.ru/CellCultureTechnologies
  /CellCultureTechnologies.htm
  

• 11 слайд

  Рекомбинантный ФСГ, полученный методом генной инженерии из клеток яичника китайского хомячка. Стимулирует образование фолликулов. Действие обусловлено тем, что при парентеральном введении фоллитропина альфа происходит образование зрелых граафовых пузырьков.
  Фоллитропин альфа связывается в клетках-мишенях с рецепторами, увеличивает пролиферацию эндометрия и повышает уровень эстрогенов.
  

• 12 слайд

  бутирилхолинэстераза крови человека (БуХЭ)
  

• 13 слайд

  Достижения ГИ
  В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин.
  Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм.
  В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот.
  Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.
  

• 14 слайд

• 15 слайд

  Недостатки производства и применения инсулинов из животного сырья:
  большой объем производства требует наличия здоровых животных;
  сложность выделения, хранения и транспортировки сырья;
  антигенные свойства в связи с отличием на одну аминокислоту в свином инсулине;
  не достигается полная очистка от проинсулина за исключением производства высокоочищенных препаратов;
  формирование инсулинорезистентности, что внешне выражается в развитии у больных липодистрофии.
  

• 16 слайд

  Получение инсулина человека в клетках
  Е. coli
  1 - трансформация клеток Е. coli плазмидами, которые содержат гены, кодирующие структуру А- и В-цепей инсулина;
  2 - синтез А- и В-цепей инсулина в процессе выращивания культуры трансформированных клеток Е. coli;
  3 - выделение и очистка А- и В-цепей инсулина;
  4 - пространственная укладка А- и В-цепей инсулина и окисление остатков цистеина.
  

• 17 слайд

  Компания "Генентек" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции.
  

• 18 слайд

  История развития ГИ
  Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу.
  Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот.
  

• 19 слайд

  Спустя десятилетие, в 1953 году американский биохимик Дж. Уотсон и английский физик Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии. В 1962 г. их работа была отмечена Нобелевской премией по физиологии и медицине «за открытия в области молекулярной структуры нуклеиновых кислот и за определение их роли для передачи информации в живой материи».
  Открытие двуспиральной структуры произошло после того, как Морис Уилкинс тайно показал Уотсону и Крику рентгеновский снимок молекулы ДНК, сделанный его сотрудницей Розалиндой Франклин.
  
  

• 20 слайд

• 21 слайд

  Три этапа истории развития генетической инженерии:
  Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами.
  Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.
  Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-реципиента) генов эукариот, главным образом, животных.
  

• 22 слайд

  Методы генетической инженерии
  расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами;
  секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК;
  конструирование рекомбинантной ДНК;
  гибридизация нуклеиновых кислот;
  клонирование ДНК;
  введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.
  

• 23 слайд

  2. Ферменты генной инженерии.
  Генетическая инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты. Ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности.
  

• 24 слайд

  - ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);
  - ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);
  - ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
  - ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК (нуклеазы).
  

• 25 слайд

  РЕСТРИКТАЗЫ (рестрицирующие эндонуклеазы) - узнающие и атакующие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции).
  Различают 3 основных класса рестриктаз: 1, 2 и 3. Рестриктазы 1-го класса осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы 2-го и 3-го классов узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии.
  Ферменты второго класса состоят из 2 отдельных белков: рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы, поэтому в генной инженерии используются исключительно ферменты 2-го класса.
  

• 26 слайд

  ДНК-полимераза I E. coli
  а) структура,
  б) модель взаимодействия с молекулой ДНК (Щелкунов С. Н., 1994).
  ПОЛИМЕРАЗЫ - ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК или РНК (обратные транскриптазы);
  Впервые ДНК-полимераза была выделена Корнбергом с сотрудниками в 1958 году из E. coli.
  

• 27 слайд

  Комплекс Taq-полимеразы с ДНК
  

• 28 слайд

  РНК-полимераза
  Обратная транскриптаза используется для транскрипции м-РНК в комплементарную цепь ДНК. При изучении ретровирусов, геном которых представлен молекулами одноцепочечной РНК, было обнаружено, что в процессе внутриклеточного развития ретровирус проходит стадию интеграции своего генома в виде двухцепочечной ДНК в хромосомы клетки-хозяина.
  Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах. Чтобы начать синтез, ревертазе, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер).
  

• 29 слайд

  Схема синтеза двухцепочечных ДНК-копий молекул РНК
  

• 30 слайд

  ЛИГАЗЫ - соединяющие фрагменты ДНК. Они катализируют синтез фосфодиэфирной связи в 2-х цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты.
  Существует 2 типа ДНК-лигаз, отличающихся по потребностям в кофакторах и способу действия.
  ДНК-лигаза E. coli в качестве кофактора использует дифосфопиридиннуклеотид,
  лигаза фага Т4 - АТФ в присутствии Mg2+.
  Лигаза фага Т4 более универсальна, так как помимо лигирования липких концов способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами.
  

• 31 слайд

  ДНК-лигаза, осуществляющая репарацию ДНК
  

• 32 слайд

  Концевые ТРАСФЕРАЗЫ - позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК. Была обнаружена Боллумом в 1962 году в тимусе теленка.
  Именно с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы в 1972 г. был выполнен первый эксперимент по рекомбинации молекул ДНК in vitro.
  Поли (А) - полимераза E. coli была открыта Сиппелом в 1973 году.
  

• 33 слайд

  3. Характеристика рестриктаз
  Общепринято термины рестриктаза, эндонуклеаза рестрикции и сайтспецифическая эндодезоксирибонуклеаза считать синонимами.
  Все рестрикционные эндонуклеазы бактерий узнают специфические, довольно короткие последовательности ДНК и связываются с ними. Этот процесс сопровождается разрезанием либо в самом сайте узнавания, либо в каком-то другом, что определяется типом фермента.
  

• 34 слайд

• 35 слайд

  Наряду с рестрикционной активностью бактериальный штамм обладает способностью метилировать ДНК; для этого процесса характерна такая же специфичность в отношении последовательностей ДНК, как и для рестрикции. Метилаза добавляет метильные группы к адениновым или цитозиновым остаткам в том же сайте, в котором связывается рестрикционный фермент. В результате метилирования сайт становится устойчивым к рестрикции.
  http://www.sciencephoto.com/media/509748/view
  

• 36 слайд

  Первая РНК-метилаза была обнаружена в бактериальных клетках Е. Бореком в 1962 г.;
  первую ДНК-метилазу обнаружили в
  E. coli М. Голд и Дж. Хурвитц в 1964 г.
  

• 37 слайд

  http://schaechter.asmblog.org/schaechter/2011/05/
  a-protection-racket.html
  

• 38 слайд

  Системы рестрикции-модификации
  Клеточная
  рестриктаза разрушает ДНК (неметилированные сайты)
  метилаза защищает (метилирует сайты)
  фаг => сайты неметилированы
  избегание палиндромов
  репликация => гемиметилированные сайты защищены
  плазмидная – поддержание в популяции
  рестриктаза – токсин
  малая концентрация
  высокая устойчивость
  метилаза – антитоксин
  высокая концентрация
  малая устойчивость
  при входе в клетку сначала экспрессируется метилаза
  С-белки, метилирование промотора и т.п.
  

• 39 слайд

  www.xumuk.ru/biochem/254.htm
  

• 40 слайд

  Сайт рестрикции - место, распознаваемое рестриктазой (4-8 пар нуклеотидов).
  Палиндром – это последовательность-перевертыш, идентичный в обеих цепях при ее прочтении в направлении от 5'-конца к 3'-концу.
  Роль в бактериальных клетках - расщепление чужеродной (вирусной ДНК) рестриктаза/метилаза
  «Липкие» концы - короткие одноцепочечные концы двухцепочечных молекул ДНК, комплиментарные друг другу.
  Сайты узнавания из 4 п.н. встречаются в среднем один раз на 256 п.н., из 6 п.н. - 1 на 4096 п.н.; из 8 п.н. - 1 на 65500 п.н.
  Мелкощепящие и крупнощепящие рестриктазы.
  

• 41 слайд

  Реакция разрезания осуществляется в две ступени. Сначала разрезается одна цепь ДНК, а затем рядом разрезается другая. В областях, прилегающих с каждой стороны к сайту разрезания, может иметь место экзонуклеотическая деградация. Происходит эффективный гидролиз АТФ, роль которого еще не выяснена.
  

• 42 слайд

  Номенклатура рестриктаз
  В 1973 году Смит и Натанс предложили номенклатуру рестриктаз, включающую следующие пункты:
  1. Аббревиатура названия каждого фермента является производной от бинарного названия микроорганизма, содержащего данную метилазно-рестриктазную систему. Составляют по правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида.
  Streptomyces albus - Sal, Escherichia coli - Eco
  2. В случае необходимости добавляют обозначение серотипа или штамма, например, Есо B.
  

• 43 слайд

  3. Различные системы рестрикции - модификации, кодируемые одной бактериальной клеткой, обозначают римскими цифрами: Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilus influenzae).
  4. Рестриктазы обозначают буквой R (R Hind III),
  метилазы - М (М Hind III).
  5. Открытие новых рестриктаз заставило Робертса в 1978 году внести дополнения в систему рациональных обозначений ферментов: если сокращенное название совпадает для нескольких ферментов, то 2 первые буквы аббревиатуры остаются неизменными, а третья берется из последующих букв видового названия:
  Haemophilus parainfluenzae - Hpa I
  Haemophilus parahaemolyticus I - Hph I.
  

• 44 слайд

  Примеры действия рестриктаз
  Одни вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности (Hpa I, Ssp I), а другие - со сдвигом, с образованием "ступеньки" (Pst I).
  В первом случае образуются так называемые "тупые" концы, а во втором - "липкие", то есть фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в четыре нуклеотида. Такие фрагменты особенно удобны для создания рекомбинантных ДНК.
  Рестрикцирующие нуклеазы получают из различных бактерий: Нра I - Haemophilus parainfluenzae; Eco RI - из Escherichia coli, Hind III - из Haemophilus influenzae.
  

• 45 слайд

• 46 слайд

  Изошизомеразы - рестриктазы, узнающие одни и те же сайты рестрикции.
  Изошизомеры некоторых рестриктаз используются для обнаружения метилированных участков ДНК в геноме.
  
  Истинная изошизомерия
  Ложная изошизомерия
  

• 47 слайд

  4. Получение рекомбинантных ДНК
  Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.
  Ключевыми в этом определении являются слова "фрагмент ДНК" и "объединение in vitro", что указывает на сущность генетической инженерии и ее отличие от всех остальных методов получения гибридных (или химерных) организмов, таких как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и т.д.
  

• 48 слайд

  1. Сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно-лигазный метод)
  Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотр. в 1973 г.
  

• 49 слайд

  2. Сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод)
  Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 году Полем Бергом в Стенфордском университете (США).
  Пришивание «липких» концов и сшивка фрагментов ДНК
  

• 50 слайд

  Схема коннекторного метода
  

• 51 слайд

  3. Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами
  когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или "переходники").
  Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотр. в 1977 г.
  

• 52 слайд

  Схема использования линкерных молекул
  

• 53 слайд

  Основные понятия темы
  рестрикция, секвенирование, гибридизация, клонирование, рекомбинация.
  рестриктазы, лигазы, полимеразы, обратные траскриптазы, концевые трансферазы, линкеры.