ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ ЛИНИЙ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ IN VITRO

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ ЛИНИЙ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ IN VITRO

В природных условиях лекарственные растения находится под мощнейшим влиянием абиотических и биотических факторов окружающей среды, включая ксенобиотики (радионуклиды, пестициды, тяжелые металлы и т.д.). Кроме того, всемерное расширение интенсивных технологий выращивания лекарственных культур в природных условиях требует площадей, используемых для сельскохозяйственных растений. Синтез вторичных фармакологически активных веществ (ФАВ) у растений отличается крайней лабильностью и чутко реагирует на воздействие факторов окружающей среды, приводящих к изменениям их количественного/качественного состава. Вторичным метаболитам принадлежит также существенная, а то и определяющая, роль в обеспечении многих показателей качества продукции, поскольку в группе вторичных метаболитов имеются соединения, биологическая активность которых в норме пренебрежимо мала. В то же время повышение содержания (или изменение стехиометрического соотношения) вторичных метаболитов в растениях, полученных в культуре клеток, подвергшихся воздействию различных физико-химических факторов, представляет потенциальную экономическую и социальную значимости.

Приведенные соображения явились основанием для усиления роли современных физико-химических приемов, предоставляющих информацию качественного и количественного характера о вторичных метаболитах, а также развитию основополагающих концепций, позволяющих получать экологически безопасные лекарственные субстанции. Теоретическим базой проводимой работы в физиолого-биохимическом аспекте явился разнообразный фактический материал, подтверждающий, что клеточные культуры имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционным лекарственным сырьем [1-2]:

-              наращивание биомассы идет быстрее, чем в целом растении;

-              возможность оптимизировать и стандартизировать условия выращивания;

-              получать продукцию круглый год;

-              растительные культуры in vitro могут синтезировать новые вещества с более высокой физиологической активностью;

-              получение экологически чистых продуктов независимо от климата, сезона, погоды;

-              создание клеточных линий-сверхпродуцентов;

-              сохранение пула генов редких и исчезающих растений-продуцентов (культура клеток сохраняет от уничтожения тысячи дикорастущих растений, ставших уже редкими, которые синтезируют необходимые человеку вещества);

-              экономия площадей;

-              возможность автоматизации процессов.

В этой связи целью работы является изучение характера влияния абиотических факторов (температура, свет) на биопродуктивность каллусных культур растений in vitro с последующей разработкой подходов по оптимизации технологий получения экологически безопасных вторичных метаболитов.

Объектами исследования служили длительно пассируемые каллусные культуры алтея лекарственного (Althaea officinalis L.), шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea L. Moench.). Для культивирования каллусных тканей

использовали питательную среду по прописи Мурасиге и Скуга, включающую 3 % сахарозы и фитогормоны – 0,2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, 0,5 мг/л кинетина и 2,0 мг/л β- индолил-3-уксусной кислоты. Для изучения влияния температурного фактора культивирование каллусов осуществляли в условиях микробиологического термостата в темноте при температуре 24°С (контроль), а также при пониженных температурах (18 и 21°С) и повышенных температурах (27, 30 и 33°С). В экспериментах по влиянию светового фактора каллусные культуры инкубировали в условиях люминесцентного (контроль) и светодиодного освещения с различным спектральным составом (соотношением синего (С) и красного (К) света) и интенсивностью (200 и 500 мкмоль квантов/м2∙с). Протестированы 4 режима светодиодного освещения: 1) С:К – 1:1,3 (200 мкмоль квантов/м2∙с); 2) С:К – 1:4 (200 мкмоль

квантов/м2∙с); 3) С:К – 1:2,5 (200 мкмоль квантов/м2∙с); 4) С:К – 1:4 (500 мкмоль квантов/м2∙с). Культивирование каллусов осуществлялось в отдельных боксах с индивидуальным режимом освещения биотехнологического LED-комплекса, созданного сотрудниками Центра светодиодных и оптоэлектронных технологий, на базе Института физики НАН Беларуси. Анализ прироста биомассы и уровней накопления вторичных метаболитов фенольной природы проводили с помощью спектрофотометрического метода в стационарную фазу цикла выращивания. Продолжительность ростового цикла составляла 30-32 суток.

В результате изучения температурной зависимости прироста биомассы каллусной культуры Althaea officinalis установлено, что наиболее оптимальной для роста каллусов является температура 21°С. Существенное замедление скорости ростовых процессов (практически в 3 раза) обнаружено в результате культивирования каллусов при самой высокой из протестированных температур – 33°С. Снижение температуры до 18°С вызывало уменьшение прироста биомассы каллусов в 1,2 раза. Достоверный стимулирующий эффект на содержание фенольных соединений (ФС) вызывали крайние из испытанных температур – 18 и 33ºС. При этом воздействие пониженной температуры являлось гораздо более эффективным, поскольку при этом отмечалось возрастание содержания ФС в 1,7 раза по сравнению с контролем. В случае выращивания каллусов при 33ºС содержание ФС увеличивалось не более, чем в 1,3 раза.

Для каллусной культуры Salvia officinalis максимальные показатели ростовой активности отмечались в результате культивирования при 24С. Понижение температуры до 18С приводило к замедлению прироста биомассы в 1,4 раза, при ее повышении до 33С происходило практически двухкратное ингибирование ростовых процессов. Температурная зависимость накопления ФС, в частности фенолкарбоновых кислот (ФК), характеризовалась наличием одного хорошо выраженного максимума при 18С. Рост содержания исследуемых вторичных метаболитов достигал более 2 раз по сравнению с контролем.

В случае каллусной культуры Echinacea purpurea температуры оптимальные для роста и накопления таких фенилпропаноидов, как гидроксикоричные кислоты (ГКК) и их производные, также различались между собой. Максимальный прирост биомассы каллусов отмечался при 24 и 27С, тогда как для накопления ГКК в качестве наиболее оптимальной из протестированных температур выступала температура 21С. В отличие от предыдущих культур в условиях пониженной температуры (18°С) ингибирование ростовых процессов проявлялось в большей степени по сравнению с инкубацией при повышенной до 33°С температуры.

Выявленные закономерности могут быть использованы при разработке двухстадийного режима культивирования исследуемых каллусных культур. В частности, на первом этапе, обеспечивающем условия для оптимального прироста биомассы, культивирование каллусов Althaea officinalis должно осуществляться при 21С, в случае Salvia officinalis и Echinacea purpurea – при 24С. На втором этапе, направленном на усиление синтеза целевых вторичных метаболитов, рекомендуется проводить инкубацию каллусных культур Althaea officinalis и Salvia officinalis при 18С, тогда как для каллусов Echinacea purpurea наиболее целесообразно снижение температуры культивирования до 21С.

Использованные в работе каллусные культуры существенно различались между собой по характеру ответных реакций на светодиодное освещение разного спектрального состава и интенсивности. Следует отметить, что каллусная культура Althaea officinalis оказалась наименее чувствительной к замене люминесцентного освещения на светодиодное. В частности, при культивировании каллусов в условиях светодиодного освещения достоверный стимулирующий эффект был зарегистрирован только в случае анализа содержания флавоноидов. Повышение уровней их накопления составляло в среднем 1,3-1,4 раза по сравнению с контролем.

Для каллусной культуры Salvia officinalis выявлено значительное влияние светодиодного освещения определенного спектрального состава на образование фенилпропаноидов и флавоноидов. Установлено, что наиболее выраженное повышение содержания суммы ФС (в 2 раза относительно контроля) отмечалась при светодиодном освещении с соотношением синего и красного света 1:4 (режимы 2 и 4). При этом увеличение интенсивности освещения от 200 до 500 мкмоль квантов/м2∙с приводило к росту содержания фенилпропаноидов в 1,3–1,4 раза относительно контроля, а флавоноидов – в 1,5 и 1,7 раза, соответственно.

Для каллусной культуры Echinacea purpurea стимуляция образования ФС отмечалась при использовании всех вариантов светодиодного освещения, для которых интенсивность освещения составляла не более 200 мкмоль квантов/м2∙с. В отличие от других культур при инкубации каллусов Echinacea purpurea в условиях светодиодного освещения с интенсивностью 500 мкмоль квантов/м2∙с происходило снижение уровней накопления ГКК и их производных. Среди использованных режимов наиболее эффективными по сравнению с люминесцентным освещением в плане повышения синтеза ГКК и флавоноидов оказались варианты, спектральный состав которых характеризовался соотношением синего и красного света, равным 1:1,3 и 1:4 и уровнем освещенности 200 мкмоль/м2∙с. Содержание фенилпропаноидов повышалось в среднем в 1,2 раза, а флавоноидов – в 1,9 раза.

Сравнительный анализ полученных результатов позволяет сделать заключение о более выраженном положительном влиянии светодиодного освещения с преобладающей долей красного света на синтез флавоноидов во всех исследуемых каллусных культурах по сравнению с фенилпропаноидами.

На основании данных о качественных/количественных параметрах вторичного обмена исследуемых культур построена концепция технологии, позволяющая: а) повысить качественные показатели продукции ФАВ; б) совершенствовать меры по экологизации; в) проводить отбор линий с повышенным уровнем синтеза вторичных метаболитов. Проведенное изучение общих и специфических показателей роста и биохимических механизмов синтеза вторичных метаболитов позволяют создавать предпосылки для получения экологически чистых лекарственных субстанций.

Список использованных источников

1.            Ramachandra Rao, S. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites / S. Ramachandra Rao, G.A. Ravishankar // Biotechnology Advances. – 2002. – Vol. 20. – P. 101–153.

2.            Karuppusamy, S. A review on trends in production of secondary metabolites from higher plants by in vitro tissue, organ and cell cultures / S. Karuppusamy // Journal of Medicinal Plants Research. – 2009. – Vol. 3(13). – P. 1222– 1239.